Investigations on the role of DNA methylation governing enzymes (TET1 3, DNMT1 and DNMT3A) for male fertility and ART treatment

Abstract

Epigenetic reprogramming during male germ cell differentiation plays a crucial role in regulating genome functions at critical stages of development. DNA methylation profiles are mainly established and maintained by DNMT family members, whereas TET dioxygenases are essential for active DNA demethylation in the paternal pronuclei and in ESCs.The present study focused on the expression of TET1 3 enzymes during human spermatogenesis and in mature spermatozoa. Furthermore, it should be clarified whether aberrant expression of TET1 3, DNMT1 and DNMT3A mRNAs are associated with aberrant imprinting of the H19 gene, male subfertility and poor outcome of ICSI treatment.During normal human spermatogenesis TET1 3 mRNAs are present in the cytoplasm of pachytene spermatocytes from stage I to stage V, while TET1 3 proteins are successively expressed: TET2 is expressed in the cytoplasm of late pachytene spermatocytes of stage V, then TET1 can be observed in the nuclei of step 1 round spermatids at stage I, and TET3 in the nuclei of step 3 round spermatids at stage III. 5hmC appears only in step 5 elongated spermatids. All three TETs are still detectable at the mRNA and protein level in mature sperm cells in considerable amounts.TET1 3, DNMT1 and DNMT3A mRNA levels in spermatozoa are significantly reduced in subfertile patients. In addition, they are closely associated with male age and routine semen parameters. TET2 and TET3 mRNA levels in mature sperm cells are significantly associated with pregnancy and fertilization rate after ICSI treatment, respectively. Aberrant methylation of TET3, but not TET1 2, CpG-promoter might down-regulate TET3-mRNA transcription. Finally, DNA methylation reprogramming enzymes, especially DNMT3A, might be associated with the methylation pattern of the imprinted gene H19 in human mature spermatozoa.Our data provide first hints that TETs enzymes and DNA-demethylation are essential for male germ cell differentiation. In addition, TET1 3, DNMT1 and DNMT3A mRNA levels in human mature spermatozoa seems to be important for male fertility and success of ART treatment. Die epigenetische Reprogrammierung während der männlichen Keimzelldifferenzierung spielt für die Regulation der Genexpression eine entscheidende Rolle. Während die Methylierung der DNA vornehmlich durch Enzyme der DNMT-Familie etabliert und aufrecht erhalten wird, erfolgt die active Demethylierung der DNA im paternalen Pronukleus und in embryonalen Stammzellen durch TET Dioxygenasen.In der vorliegenden Studie wurde die Expression der TET1 3 Enzyme während der Spermatogenese und in ejakulierten menschlichen Spermien untersucht. Darüber hinaus sollte geklärt werden, ob eine aberrante Expression von TET1 3, DNMT1 und DNMT3A mRNA mit einem abnormalen Imprinting des H19 Gens bzw. männlicher Subfertilität und/oder dem Ergebnis einer ICSI-Behandlung assoziiert ist.Während der normalen Spermatogenese konnten TET1 3 mRNAs im Zytoplasma von pachytänen Spermatozyten (Stadium I-V) nachgewiesen werden, wohingegen die TET1 3 Proteine ein sukkzessives Expressionsmuster zeigten. So wurde TET2 im Zytoplasma von späten pachytänen Spermatozyten (Stadium V) exprimiert. TET1 hingegen war in den Zellkernen von step 1 runden Spermatiden (Stadium I) und TET3 in den Zellkernen von step 3 runden Spermatiden (Stadium III) nachweisbar. 5hmC war ausschließlich in step 5 elongierten Spermatiden (Stadium V) zu sehen. Alle drei TET Enzyme sind zudem sowohl auf mRNA-, als auch auf Protein-Ebene in ejakulierten Spermien nachzuweisen.In subfertilen Patienten ist die Menge an TET1 3, DNMT1 und DNMT3A mRNAs in Spermien significant reduziert. Darüber hinaus zeigt die mRNA-Menge eine Korrelation mit dem Alter des Mannes und mit Routine-Samenparametern. Die Menge an TET2 bzw. TET3 in Spermien ist zudem significant mit der Schwangerschaftsrate bzw. Der Fertilisierungsrate nach ICSI korreliert. Eine abnormale Methylierung von CpG-Inseln im TET3 Genpromoter, aber nicht in den Promotoren von TET1 und TET2, könnte somit die Transkription der TET3 mRNA herunter regulieren. Schließlich lassen unsere Ergebnisse eine Assoziation von DNMT3A mit dem Methylierungsmuster des paternalen Imprintinggens H19 in Spermien vermuten.Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Ergebnisse dieser Studie erste Hinweise dafür liefern, dass TET Enzyme und DNA-Demethylierung eine wichtige Rolle in der männlichen Keimzelldifferenzierung spielen. Darüber hinaus scheint die Menge an TET1 3, DNMT1 und DNMT3A mRNA in Spermien einen Einfluss auf die männliche Fertilität bzw. den Erfolg einer ICSI-Behandlung zu haben.