Vorkommen nikotinischer Acetylcholinrezeptoren und ihrer Modulatoren im murinen Urothel am Beispiel der experimentellen Blasenauslaßobstruktion

Abstract

Bei der überaktiven Blasenfunktionsstörung (OAB) handelt es sich um eine weitverbreitete Erkrankung multifaktorieller Genese. Aktuell werden zur Behandlung hauptsächlich anticholinerge Medikamente eingesetzt, deren Wirkweise auf das Vorhandensein non-neuronaler Freisetzungsmechanismen und einer auto- bzw. parakrinen Wirkung von ACh schließen lässt. Bis dato wurden im Urothel von Mensch, Maus und Ratte sowohl ACh als auch dessen nikotinische und muskarinische Rezeptoren (nAChR und MR) nachgewiesen. Besonderes Interesse gilt darüber hinaus den allosterischen unklassischen Liganden Lynx und SLURP, welchen eine regulatorische Funktion auf nAChR zugeschrieben wird.Am Mausmodell der artifiziellen partiellen Blasenauslaßobstruktion (pBOO), einer möglichen Ursache der OAB, wurde in der vorliegenden Arbeit am Urothel untersucht, ob nAChR auf mRNA-Ebene reguliert werden, des Weiteren, ob Lynx und SLURP im Urothel exprimiert bzw. reguliert werden.Hierzu wurden obstruierte (BOO), scheinoperierte (Sham) und unbehandelte (Nativ) Mäuse miteinander verglichen, um anhand cystomanometrischer Messungen die pathophysiologischen Auswirkungen der OAB darstellen zu können. Anschließend wurde das entfernte Urothel mittels RT-PCR auf das Vorkommen bzw. die Expression der Gene der nAChR alpha3, alpha5, alpha7, alpha9 und alpha10, beta2-beta4, Lynx-1-3 sowie SLURP-1 und SLURP-2 zwischen Nativ und BOO untersucht. In der Real-Time RT-PCR wurde die relative Expression von Lynx-2 zwischen den drei Gruppen (Nativ, Sham, BOO) bestimmt. Zur Lokalisierung von Lynx-3 im Urothel wurden transgene Lynx-3-eGFP Mäuse unter Anwendung der indirekten Immunhistochemie verwendet.Im Rahmen der Cystomanometrie verzeichneten wir signifikante Ergebnisse in Bezug auf den Anstieg von Harnblasengewicht, Harnblasendruck und Residualvolumen zwischen den Vergleichsgruppen Nativ und BOO. Hier kam es zwischen Nativ und Sham Tieren ebenfalls zu einem Anstieg des Harnblasengewichtes ohne Anstieg des Residualvolumens.In der RT-PCR konnte zwischen den Nativ- und BOO-Mäusen eine tendenziell vermehrte Expression für die Gene der nAChR alpha5, alpha7, alpha9, alpha10 und beta3 sowie Lynx-3 und SLURP-1 nachgewiesen werden. Der nAChR alpha3 wurde weder in Nativ noch in BOO detektiert. Die Untereinheiten von beta2, beta4, Lynx-1 und Lynx-2 kamen in Nativ und BOO vor, sie unterlagen jedoch keiner Regulation auf mRNA-Ebene. Im Vergleich zurKontrollgruppe (n=3) zeigte sich eine Reduktion der Genexpression von SLURP-2 in den BOO-Mäusen (n=1). In Bezug auf Lynx-2 konnten wir auch in der Real-Time RT- PCR keine signifikanten Unterschiede in der Expression beobachten. Mittels indirekter Immunhistochemie konnte zusätzlich die Lokalisation von Lynx-3 den Basalschichten des Urothels zugeordnet werden.In Folge der durchgeführten pBOO kam es sowohl in der BOO- als auch der Sham- Gruppe zu einer hypertrophen Veränderung der Harnblasenwand, jedoch ohne Auswirkung auf die Harnretention in den Sham-Mäusen. Dies bedeutet, dass lediglich Teilkriterien einer BOO auftraten, da sich die Miktionsintervalle nicht wie erwartet verkürzten. Wir gehen davon aus, dass die Harnblase bei zunehmender Obstruktion zunächst einem Umbau der Gewebsstrukturen unterliegt und erst bei höhergradiger Obstruktion eine Detrusorüberaktivität auftritt. Des Weiteren lässt sich festhalten, dass die in der vorliegenden Studie untersuchten Komponenten des NNCS nach Blasenauslaßobstruktion im Urothel vorkommen, jedoch keine statistisch signifikante Aussage zu einer veränderten Expression getroffen werden kann.Zusammenfassend sind aus den erhobenen Daten folgende Aspekte zu diskutieren. Denkbar wäre eine vorübergehende Kompensationsfähigkeit der Harnblase auf veränderte Außenreize, sprich erhöhten intravesikalen Druckverhältnissen bei zunehmender Obstruktion. Hierbei könnten neben den nAChR die unklassischen Liganden Lynx und SLURP durch ihre Modulationsfähigkeit auf die Funktion der nAChR eine entscheidende Rolle im Hinblick auf Zellhomöostase, -proliferation und - adaptation spielen. Somit könnte dies den Schutz der Barrierefunktion des Urothels und dessen Integrität unter steigernden Druckverhältnissen in der Harnblase zusätzlich beeinflussen. Diese Erkenntnisse könnten das Verständnis derzeitiger Therapieansätze und Komorbiditäten ergänzen und darüber hinaus zu neuen medikamentösen Strategien in der Behandlung der OAB führen. The syndrome of overactive bladder (OAB) is a widespread disease of multifactorial etiolology. Current treatment is primarily anticholinergic drugs, whose mode of action suggests the presence of non-neuronal release mechanisms and an auto/paracrine effect of acetylcholine (ACh). Hitherto, ACh and its nicotinic and muscarinic receptors (nAChR und MR) have been detected in human and murine urothelium. Moreover, there is a particular interest in the allosteric modulators Lynx and SLURP, to which a regulatory function on nAChRs has been attributed.In this study, the mouse model of artificial partial bladder outlet obstruction (pBOO), a potential reason for OAB, was investigated to determine whether nAChRs are regulated on an mRNA level, and furthermore, whether Lynx and SLURP are expressed and regulated in the urothelium.For this purpose, obstructed (BOO), sham-operated and untreated mice were compared by means of cystometry to demonstrate pathological effects on OAB. Subsequently removed urothelium was investigated for incidence and expression of nAChR subunits alpha3, alpha5, alpha7, alpha9 and alpha10, beta2-beta4, Lynx-1-3 as well as SLURP-1 and SLURP-2 between untreated animals and BOO. In real-time RT-PCR, relative expression of Lynx-2 was determined between untreated, sham-operated and BOO mice. Lynx-3-eGFP mice were used to detect Lynx-3 by immunohistochemistry.Cystometry showed significant results for increased bladder weight, detrusor pressure and residual volume between untreated and BOO mice. There was also increased bladder weight and residual volume between untreated and sham-operated mice. In RT- PCR, a tendency towards increased expression between untreated and BOO mice was detected for nAChR subunits alpha5, alpha7, alpha9, alpha10 and beta3, also for Lynx-3 and SLURP-1.The nAChR subunit alpha3 was not detected in either untreated or in BOO animals. The nAChR subunits beta2, beta4, Lynx-1 and Lynx-2 were detected in untreated and BOO mice, but there was no regulation at the mRNA level. In comparison to the control group (n=3), there was reduction of gene expression of SLURP-2 in BOO mice (n=1). In relation to Lynx-2, there was no significant difference in expression in real-time RT- PCR. By means of indirect immunohistochemistry, localization of Lynx-3 was assigned to basal layers of urothelium.As a result of the pBOO carried out, there was a hypertrophic shift of the bladder wall in both BOO and sham-operated mice, but with no effect on the urine retention in sham-operated animals. This implies the appearance of only some criteria of BOO symptoms, because micturition intervals were not reduced as expected. We assume that with increasing obstruction of the urinary bladder, an alteration of tissue structure initially occurs and only higher degrees of obstruction lead to detrusor overactivity. In addition we can state that components of the NNCS we investigated in this study are present in the urothelium after BOO, however, no significant prediction of an altered expression can be made.In conclusion, from the data collected, we discuss the following aspects: A transient compensatory balance of the urinary bladder by altered external stimuli is feasible, i.e. increased intravesical pressure while increasing obstruction. Here, in addition to nAChRs, Lynx and SLURP could play a crucial role in the function of nAChRs because of their ability to modulate them with respect to cell homeostasis, proliferation and adaptation. Consequently, this could additively influence the barrier function and integrity of the urothelium according to the increasing pressure ratio in the urinary bladder. These findings could lead to a better understanding of current therapy strategies and comorbidities, as well as to new pharmacological strategies for the treatment of OAB.