Extrazelluläre Ribonukleinsäure als Induktor der TACE-Aktivierung und TNF-alpha Freisetzung von Makrophagen

Abstract

Extrazelluläre Ribonukleinsäure (eRNA) wird bei Gewebetraumata, Ischämie oder Tumorwachstum als prothrombotischer, proinflammatorischer und permeablilitätssteigender Faktor freigesetzt. Über ihre Wirkung auf murine und humane Makrophagen ist jedoch wenig bekannt, sodass ihr Einfluss auf die TNF-alpha Freisetzung dieser Zellen genauer untersucht wurde.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben gezeigt, dass eRNA aus murinen Fibroblasten die Freisetzung von TNF-alpha durch Aktivierung der Metalloproteinase TACE, auch ADAM17 genannt, induziert und als danger-associated molecular pattern (DAMP) wirken kann. Dabei wurde TNF-alpha in zeit- und konzentrationsabhängiger Weise von THP-1 Makrophagen freigesetzt und konnte als Mediator einer frühen Immunantwort per ELISA identifiziert werden. Sekundäre Effekte durch Bindung des freigesetzten TNF-alpha an TNF-Rezeptoren konnten dabei ausgeschlossen werden. Die spezifische Inhibierung der in der TNF-alpha Freisetzung aktiven Enzyme ADAM10 und ADAM17 entschlüsselte dabei ADAM17 als hauptverantwortliches Enzym der TNF-alpha Freisetzung. Auch die Beteiligung von MAP-Kinasen und des NF-kappaB Signalweges in der ADAM17-Aktivierung von Makrophagen konnte aufgezeigt werden. Außerdem induzierte eRNA unabhängig von der ADAM17-Aktivierung die mRNA-Expression weiterer inflammatorischer Zytokine, wie IL-1beta, CCL3, CCL4 und IL-8. Im Gegensatz zu LPS war eRNA jedoch nicht in der Lage die Caspase-1 ausreichend zu aktivieren, um IL-1beta freizusetzen. Des Weiteren konnte MyD88 in MyD88-/--Maus-Makrophagen als weiteres Schlüsselprotein der eRNA-induzierten TNF-alpha Freisetzung identifiziert werden. Dies führte dazu, dass durch Verwendung weiterer Toll-like-Rezeptor-Agonisten und eines TLR-4-Antagonisten der TLR-2 und TLR-4 in den Mittelpunkt der eRNA induzierten TNF-alpha Freisetzung rückte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass extrazelluläre self-RNA als DAMP die Freisetzung von TNF-alpha via extrazellulärer Toll-like-Rezeptoren in Makrophagen zu initiieren vermag. Extracellular RNA (eRNA) is being released as a prothrombotic, proinflammatory and permeability-increasing factor during tissue traumatisation, ischemia or tumor growth. However, knowledge is scarce about ist effect on murine or human macrophages. Therefore, ist influence on the release of TNF-alpha of these cells needed tob e examined more precisely.The results of this paper show that eRNA can function as a damage-associated molecular pattern (DAMP), and thereby triggert he shedding of bioactive tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) from macrophages, mediated by a TNF-alpha-converting enzyme (TACE or ADAM17) a membrane-bound disintegrin metalloproteinase. The release of TNF-alpha from macrophages proceeded in a time- and concentration-dependent manner. TNF-alpha was identified as a mediator of early immune response. Secondary effects caused by a bonding unit of the released TNF-alpha and TNF-receptors could be excluded. Using specific inhibitors for ADAM17 and ADAM10, both involved in the TNF-alpha sheddase reaction, ADAM17 was identified tob e mainly responsible fort he release of soluble TNF-alpha. Further it is proven that MAP-kinases and NF-kappaB signaling pathways are involved in these inflammatory actions of eRNA. In addition, eRNA induced the mRNA-expression of other cytokines like IL-1beta, CCL3, CCL4, or IL-8 from macrophages, yet by an ADAM17-independent mechanism. Contrary to TNF-alpha, eRNA could not induce liberation of IL-1beta by activation of caspase-1. Moreover, MyD88 played an important role in the activation of macrophages. Using different Toll-like-receptors-agonists and a TLR-4-antagonist we focused on eRNA recognition by TLR-2 and TLR-4. These results indicate that extracellular self-RNA functioning as a damage-associated molecular pattern may initiate the inflammatory response by inducing the early release of TNF-alpha from macrophages and furthermore, Toll-like-receptors 2 and 4 are probably involved in this process.