Intrazelluläre Lokalisation der mikrobiellen Transglutaminase und ihr Einfluss auf den Transport von Gliadin innerhalb des menschlichen Duodenalepithels

Abstract

Die Zöliakie ist eine komplexe inflammatorische Erkrankung, welche sich in genetisch prädisponierten Individuen nach Verzehr von Gliadin und artverwandten Prolaminen manifestieren kann. Eines der diagnostischen Kriterien dieser Erkrankung ist die Vermehrung CD8⁺ T-Zellen innerhalb des Duodenalepithels, die zur Zerstörung der Schleimhaut beitragen. Die Mechanismen, mittels derer diese Lymphozyten ihre zytotoxischen Effekte ausüben, sind bisher nicht gänzlich verstanden, sodass die Kreuzpräsentation eine Rolle im Rahmen der Zöliakie spielen könnte. Die steigende Inzidenz der Erkrankung innerhalb der letzten Jahrzehnte scheint durch die Einwirkung von Umweltfaktoren bedingt zu sein. Einer dieser Faktoren ist möglicherweise die mikrobielle Transglutaminase (mTG), ein Enzym, welches nicht nur in der Herstellung verschiedenster Lebensmittel eingesetzt wird, um Textur oder funktionelle Eigenschaften der Produkte zu verändern, sondern auch durch die intestinale Mikrobiota freigesetzt werden könnte. Obwohl dieses Protein eine völlig unterschiedliche Aminosäuresequenz und Ultrastruktur aufweist, teilt es enzymatische Eigenschaften mit der humanen Gewebstransglutaminase (TG2), dem zentralen Autoantigen der Zöliakie. Die Hypothese dieser Arbeit besagt, dass mTG und Gliadin von Enterozyten aufgenommen und in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert werden, was auf eine Kreuzpräsentation exogener Antigene durch diese Zellen hindeutet.Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wurden Duodenalbiopsien von 7 Zöliakiepatienten und 11 Kontrollen unter Verwendung von Ussing-Kammer-Slidern strikt von apikal inkubiert. Dabei wurden von jedem Probanden 2 Biopsien gewonnen, eine wurde ausschließlich mit mTG, die andere gleichzeitig mit mTG und mit Frazer´s Fraction (FF) inkubiert. Die Auswertung erfolgte auf immunelektronenmikroskopischer Ebene unter Verwendung von Antikörpern gegen PDI (ER-Marker) sowie gegen LAMP2 (Marker für späte Endosomen). Außerdem wurde der Effekt einer viertägigen RANKL-Stimulation auf die Aufnahme von mTG und die Expression des M-Zell-Markers GP2 mittels Im-munfluoreszenzmikroskopie in einem Zellkulturmodell untersucht.Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass mTG und Gliadin von Enterozyten und in größerem Ausmaß von RACE-Zellen aufgenommen und in das ER transportiert werden. In diesem Zusammenhang enthielt das ER von RACE-Zellen in Zöliakiebiopsien signifikant mehr Antigene, als das von RACE-Zellen in Kontrollproben. Weiterhin zeigte sich eine deutliche Markierung der mTG innerhalb der lamina propria, eine Beobachtung, die für Gliadin nicht gemacht werden konnte. Bei simultaner Inkubation von Gliadin und mTG wurden einige Unterschiede in der intrazellulären Verteilung von Gliadin bei Zöliakiepatienten und Kontrollen dargestellt, welche möglicherweise auf einen Effekt der mTG zurückzuführen sind. Schließlich konnten HT-29 Zellen (in vitro) mittels RANKL-Stimulation RACE-Zellen induzieren, welche sich durch ihre klassische zytosolische und nukleäre Antigenaufnahme von mTG und Gliadin sowie die Expression von GP2, einem M-Zell-Marker auszeichneten.Dies ist die erste Studie, in der der intraepitheliale Transport der mTG untersucht wurde. Die erzielten Ergebnisse legen nahe, dass die mTG die intrazelluläre Lokalisation von Gliadin beeinflusst und dass der Mechanismus der Kreuzpräsentation eine Rolle in der Pathogenese der Zöliakie spielen könnte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die mTG die basolaterale Membran sowie die lamina propria erreicht und somit die Voraussetzung zu einer antigenen Interaktion mit Zellen des Immunsystems gegeben ist. Da mTG nicht nur in einem enzymatisch inaktiven Zustand mit Nahrungsmitteln in unseren Darm gelangt, sondern womöglich auch in einer aktiven Form durch die intestinale Mikrobiota freigesetzt wird, sind weitere Untersuchungen in Bezug auf die Sicherheit der mTG und ihre Rolle in der Pathogenese der Zöliakie notwendig. Diese Untersuchungen sprechen dafür, dass zum Schutze der Verbraucher eine eindeutige Deklaration der Lebensmittel, bei deren Verarbeitung dieses Enzyms zum Einsatz kam, notwendig ist. Celiac disease (CD) is a complex inflammatory disorder in genetically predisposed individuals, triggered by the ingestion of gliadin and related prolamines. One of the diagnostic hallmarks of the disease is the infiltration of duodenal epithelium by CD8⁺ T-cells which contribute to the damage of the mucosa. The mechanisms by which these lymphocytes exert their cytotoxic effects are not fully understood, so that cross-presentation might take place in CD. As the incidence of the disease increased over the past decades, environmental factors may play a major role in the pathogenesis. One of these factors might be microbial transglutaminase (mTG), an enzyme which is frequently used in food industry to achieve specific textures and characteristics of various food products and which could also originate from the intestinal microbiome. This protein, though showing a different amino acid sequence and ultrastructure, shares enzymatic properties with the human tissue transglutaminase (TG2), the autoantigen in CD. In this study we hypothesized that mTG and gliadin are taken up and transported into the ER of enterocytes, thus indicating cross presentation of exogenous antigens.Thus, we performed strict apical incubation of duodenal biopsies from 7 CD patients and 11 controls using Ussing chamber slider. Of each patient 2 biopsies were obtained, one was incubated with mTG alone and one with mTG and simultaneously with Frazer s Fraction (FF). Evaluation was carried out at an immunoelectronmicroscopical level using antibodies against PDI (ER-marker) and LAMP2 (marker for late endosomes). Furthermore, we examined the effect of RANKL on the uptake of mTG and the expression of the M-cell marker GP2 by immunofluorescence microscopy using a cell culture model.We were able to demonstrate that mTG and gliadin are taken up and transported into the ER of enterocytes and to a greater extent of RACE cells. In this context, RACE cells of CD patients contained more exogenous antigens in the ER than RACE cells of controls. In addition, mTG showed intense labeling within the lamina propria, which could not be observed for gliadin. Using simultaneous incubation of biopsies with gliadin and mTG, we observed differences in the distribution of gliadin within the tissue from CD patients and controls, which might be traced back to an effect of mTG. By in vitro-stimulation of HT-29 cells with RANKL, we were able to induce RACE cells, which were characterized by an increased cytosolic and nuclear uptake of mTG and gliadin as well as the expression of the M cell marker GP2.This study was the first to investigate the intraepithelial transport of mTG. Our findings reveal that mTG may influence the intracellular localization of gliadin and that cross presentation by enterocytes and RACE cells might play a role in CD pathogenesis. Moreover, we demonstrated that mTG reaches the lamina propria, indicating a transepithelial passage within 1 hour. Since mTG may not only been taken up with food stuffs but could also be produced by bacteria within the intestinal microbiota, further investigations are needed with regard to food safety and the role of mTG in CD pathogenesis. Our investigations suggest a clear declaration of mTG-treated food products for consumer protection.