Hepatitis-B-Virus-Oberflächenproteine beschleunigen die Zunahme cholestatischer Lebererkrankungen und Tumorprogression im Abcb4-knockout Mausmodell

Abstract

HBV-Infektionen gehören zu den meist verbreiteten Infektionen weltweit und sind die häufigste Ursache der Leberzirrhose und des Hepatozellulären Karzinoms. Die selten vorkommende Primär Sklerosierende Cholangitis gehört zu den chronisch verlaufenden cholestatischen Lebererkrankungen unklarer Ätiologie und kann in der Folge zu progressiver Cholestase und ebenfalls zur Zirrhose führen.Sowohl das HBV-tg- als auch das Abcb4-/- Mausmodell sind gut etabliert:HBV-tg Mäuse auf Balb/c Hintergrund, die leberspezifisch das große Hüllenprotein von humanem HBV exprimieren, zeigen eine mit dem Alter zunehmende Akkumulation von viralen Proteinen in den Hepatozyten und in der Folge ER-Stress, eine progrediente Leberschädigung und ein HCC.Abcb4-/- Mäuse stellen ein gut reproduzierbares Modell für Cholangiopathien dar. Die Tiere zeigen fokale Obliteration der Gallengänge und konzentrische periduktale Fibrose. Diese Merkmale sind mit denen der primär- und sekundär sklerosierenden Cholangitis beim Menschen vergleichbar.Ziel der vorliegenden Studie war es durch Kreuzung der HBV-tg und Abcb4-/--Mauslinien ein Second Hit Modell zu entwickeln, welches die Auswirkungen des Zusammenspiels von HBV und Cholestase verstehen lässt.Um das Ausmaß der Schädigungen und hepatischen Funktionseinschränkungen im Abcb4-/-/HBV-tg Modell nachweisen zu können, wurden Leber- und Serumproben der 7-8, 12-16 und 52 Wochen alten Tiere untersucht. Analysiert wurden u.a. die Aktivität der Serumtransaminasen und der Gesamtgehalt an hepatischem Hydroxyprolin. Weiterhin wurden die Konzentrationen verschiedener konjungierter und unkonjugierter Gallensäuren bestimmt. Zudem wurden histologische Analysen mittels Hämatoxylin-Eosin- und Sirius-Red-Färbung durchgeführt. Immunhistochemische Färbungen führten wir für Desmin und GFAP als Marker der Aktivität hepatischer Sternzellen, für die tumorspezifischen Marker Glutamin Synthetase, Typ IV Kollagen, Ki67 und für HBsAg durch. Mittels Western Blot wurden ER-Stress- und Karzinogenese-assoziierte Signaltransduktionswege untersucht.Im Abcb4-/-/HBV-tg Modell zeigte sich gegenüber den Ursprungsmodellen, HBV-tg und Abcb4-/-, eine Zunahme der hepatozellulären Schädigung. Dies spiegelte sich in einem Anstieg der Serum- ALT Konzentration, verstärkter Inflammation in der H&E Färbung und Zunahme der Fibrose in der Sirius-Red-Färbung wider. Weiterhin zeigte sich im Abcb4-/-/HBV-tg Modell eine verringerte HBsAg Akkumulation, die aber keinen Einfluss auf die mittels Western Blot Analysen bestimmten ER-Stress Marker hatte.Die Erhöhung der Gesamtkonzentration der Serumgallensäuren und die relative Abnahme der protektiven Gallensäure TUDCA führten im Abcb4-/-/HBV-tg Modell zu einer vermehrten Parenchymschädigung.Die prä-kanzerogene Pathogenese und die Aktivierung HCC-assoziierter Signalwege zeigten sich im Abcb4-/-/HBV-tg Modell kumulativ verstärkt. In der Folge potenzierten sich Anzahl und Größe der Lebertumoren.Wir haben somit erstmals ein murines Multiple Hit Modell für Cholestase- und HBV- induzierten Leberschaden beschrieben.Die vorliegende Studie legt daher nahe, dass eine Senkung der HBsAg Expression bei chronisch HBV- infizierten Patienten mit biliärer Beteiligung eine Verbesserung der Therapie und Prognose bedeuten könnte. HBV-infections are among the most prevalent infections worldwide and are the most common cause of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The rare primary sclerosing cholangitis is one of the chronical cholestatic liver diseases of unclear aetiology and can lead to progressive cholestasis and also causes cirrhosis. The HBV-tg as well as the Abcb4-/--mice strain are well established: HBV-tg mice bred on background BALB/c, which liver-specifically express the envelope protein of human HBV, show an age-related accumulation of viral protein in the hepatocytes. This, in consequence, causes ER-stress, progredient liver damage and hepatocellular carcinoma.Abcb4-/--mice present a highly reproducible model for cholangiopathy. The animals show focal obliterations of the biliary tracts and concentric periductal fibrosis. These characteristics are comparable to primary and secondary sclerosing cholestasis in humans. It was the aim of the study at hand to develop a second hit model by crossbreeding HBV-tg and Abcb4-/--mice strains, which would illustrate the interaction of HBV and cholestasis. To be able to show the extent of damage and loss of hepatic function in the Abcb4-/-/HBV-tg model, liver and serum samples of the animals were taken at ages 7-8, 12-16 and 52 weeks. Among other factors, the serumtransaminases activity and the total content of hepatic hydroxyprolin were analysed. Furthermore, different conjugated and unconjugated serum bile acid concentrations were measured. Additionally, histological analyses were carried out via hematoxylin-eosin and sirius-red staining. Immunohistochemical stainings were done for Desmin and GFAP as markers of hepatic stellate cells activity, for the tumorspecific marker glutamine synthestase, type IV collagen, Ki67, and for HBsAg. Via Western Blot, ER-stress- and carcinogenisis-associated signaltransduction were examined. In comparison to the originary strains, Abcb4-/-/HBV-tg mice show an increase in hepatocellular damage. This became evident in an increase of the Serum-ALT concentration, increased inflammation in the H&E stainings and increased fibrosis in the SR-stainings. The Abcb4-/-/HBV-tg model also shows a reduced HBsAg accumulation, which does not influence certain ER-stress markers, which were analysed via Western Blot. The increase of the total concentration of serum bile acids and the relative reduction of the protective bile acid TUDCA lead to elevated liver injury in the Abcb4-/-/HBV-tg model. The precarcinogenic pathogenesis and the activation of HCC-associated signal paths were cumulatively enhanced in the Abcb4-/-/HBV-tg model. In consequence, number and size of associated liver tumors potentiated. Thus, we have for the first time described a murine Multiple Hit model for cholestasis and HBV-induced liver damage. The present study therefore indicates that a reduction of the HBsAg expression can lead to an improvement of therapy and prognosis in patients with chronic HBV-infections with biliary involvement.