Der IRF3- und IRF7-Knockout im HBs-transgenen Mausmodell

Abstract

257 Millionen Menschen sind Schätzungen zufolge weltweit an einer chronischen Hepatitis B erkrankt. Folgeerkrankungen und deren Komplikationen (z.B. Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom) führen dabei zu einem jährlichen Versterben von nahezu 900.000 Menschen. Die Immunantwort auf eine Infektion mit dem HBV wird vor allem über Interferone gesteuert. Einer der Therapieansätze zur Behandlung der chronischen Hepatitis B basiert aufgrund dessen auf Interferon-alpha, zeigt dabei aber nur bei einem Bruchteil der Behandlungen eine klinische Verbesserung in Form von Heilung bzw. Serokonversion. In dieser Arbeit wurde im Mausmodell die Rolle der Interfon-regulierenden Faktoren 3 und 7 im Rahmen der transgenen Überexpression von HBV-Oberflächenproteinen analysiert. Als zentrale Transkriptionsfaktoren der Modulation der Interferon-Antwort sollte durch einen IRF3- und IRF7-Doppelknockout in einem HBs-transgenen Mausmodell überprüft werden, ob durch den KO die Interferon-Antwort reduziert bzw. ausgeschaltet wird und welche Konsequenzen sich daraus für Interferon-stimulierte Gene ergeben. Zudem wurde untersucht, inwieweit sich eine durch den KO bedingte Veränderung der Pathologie am Mausmodell der HBs-Überexpression (sogenannte Chisari-Maus) zeigt.Leber- und Serumproben von 12 Wochen alten BALB/c-Mäusen der vier experimentellen Gruppen Wildtyp (WT), HBs-transgen (TG), IRF3/7 Knockout (KO) und TG-KO wurden mittels klinischer Laborparameter, Microarray-Analyse und qPCR, sowie im Western Blot und mittels Leber-Histologie vergleichend analysiert. Es konnte im Microarray nachgewiesen werden, dass durch das Ausschalten von IRF3 und IRF7 im HBs-transgenen Mausmodell die Expression von ISGs reduziert wird. Die Ergebnisse ließen sich in der qPCR und teilweise auch im Western Blot verifizieren. Von besonderem Interesse waren dabei Tiam2, Dbp, Crym, Cyp4a14 und Hbb-b2, für die bisher keine Interferon-Stimulation beschrieben wurde und die somit eventuell neue Ansatzpunkte einer Therapie darstellen könnten. Überprüfte Serum-Marker, insbesondere IP10 und TIMP1 wiesen deutlich verminderte Konzentrationen durch den KO auf. Die Analyse der Lebertransaminasen und der Histologie zeigten in der Überprüfung der Mauslinien keinen signifikanten Unterschied, was durch den mit 12 Wochen relativ frühen Untersuchungszeitpunkt erklärbar ist. Wir untersuchten weiter, inwieweit die Interferon-Antwort im Rahmen der HBs-Überexpression an der Pathogenese beteiligt ist, da das Ausschalten der Interferon-Antwort durch den KO keine relevante Veränderung der Leberhistologie verursachte. Das neu etablierte Mausmodell ermöglicht schlussendlich die in vivo Untersuchung der Einflüsse von IRF3 und IRF7 bei HBsAg-Transgenität und somit die Überprüfung der Rolle von Interferonen im Rahmen des Verlaufes einer chronischen Hepatitis B.Eine gezielte Antagonisierung einzelner ISGs zur Verbesserung des Outcomes einer Interferon-Therapie ist für das vorgestellte Mausmodell wegweisend. Die weitere Untersuchung der Mauslinie zu späteren Zeitpunkten (26 Wo, 52 Wo) wird zeigen, inwieweit im Rahmen der chronischen HBs-Überexpression die Inhibition von ISGs neue therapeutische Ansatzpunkte darstellen kann. 257 Million people in the world are estimated to be living with Chronic Hepatitis B infec-tion. Subsequent mortality rates due to associated long term consequences and com-plications are close to 900.000 per year. Upon infection with the Hepatitis B virus, a key element in the systemic immune response is the interferon response. Treatment of Chronic Hepatitis B therefore includes interferon-alpha as one of the available options, yet interferon-alpha therapy only leads to clinical improvement in a minority of patients. Here we introduce a new mice model established to analyze the function of Interferon-regulating Factor 3 and 7 in Chronic Hepatitis B. Both IRF3 and IRF7 are transcription factors with a key role in modulating the interferon response; thus an IRF3/7 double knockout in HBs-transgenic mice was created to analyze if the knockout would reduce or eliminate interferon response and the subsequent influence on Interferon-stimulated Genes. Furthermore, we explored the influence on general pathology of Chronic Hepatitis B. To compare effects, liver and serum samples of wildtype (WT), HBs-transgenic (TG), IRF3/7 KO (KO) and TG-KO mice, all 12-weeks-old and of BALB/c genetic background, were comparatively analyzed via Microarray, qPCR and Western blot, and by histological staining and liver-enzyme measurement.Microarray results showed that the knockout of IRF3 and IRF7 in HBs-transgenic mice led to reduction of ISG expression. The results could be verified in qPCR and partially in Western blot analysis. Of special interest were Tiam2, Dbp, Crym, Cyp4a14 und Hbb-b2, genes which until now have not been described as Interferon-regulated genes. Further investigation might reveal their role and maybe even therapeutic potential. The majority of analyzed serum cytokines, particularly IP10 and TIMP1 were also down-regulated. Concerning liver enzymes and general histological pathology, no significant influence of KO in TG was detected. As the chosen age of examination was rather early, further experiments are needed to follow up the influence of an IRF3/7 KO on HBV-related hepatic Inflammation. We furthermore analyzed the involvement of Interferon-Response in the pathogenesis of HBs expression, as the IRF3/7 KO and its subsequent deactivation of an IFN response neither aggravated nor ameliorated hepatic pathology.Our established mice model allows the in vivo exploration and analysis of the function of IRF3 and IRF7 in HBs-transgenic pathogenesis, and thus the role of interferon in the course of chronic Hepatitis B.In Hepatitis B, antagonization of certain ISGs could already be shown to improve the outcome of interferon-therapy, which gives an impression of the potential clinical relevance of our model. Further/follow-up investigations at later times of examination will show the extent to which inhibition of ISGs might offer new therapeutic approaches.