Der Effekt von Lipopolysaccharid auf die Strahlensensibilität in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom Zelllinien

Abstract

Lungenkrebs stellt die häufigste durch Krebs verursachte Todesfolge in der westlichen Hemisphäre dar (1), wobei das das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (englisch: non-small cell lung cancer; NSCLC) mit etwa 85% aller Fälle den dominierenden histologischen Subtyp darstellt (4).Die Strahlentherapie stellt alleine oder in Kombination mit Chemotherapie und Operation, eine wichtige Komponente der Krebstherapie dar. Neben diesen Therapieformern kamen in den letzten Jahren die Immuntherapie und die sogenannte targeted therapy hinzu. Bei der targeted therapy werden zum Beispiel Tyrosinkinase Inhibitoren (TKI) gegen aktivierende Mutationen des Epidermal growth factor receptor (EGFR) eingesetzt.Bakterielle pulmonale Infektionen sind eine häufige Komplikation bei der Behandlung von Patienten mit NSCLCs und verschlechtern deren Prognose (61). Diese Infektionen werden vielfach von gram-negativen Bakterien verursacht (60), deren Hauptpathogenitätsfaktor Lipopolysaccharid (LPS) darstellt (60). LPS bindet in pulmonalen Epithelzellen an den Toll-like receptor 4 (TLR-4), sodass es zu einer Entzündungsantwort kommt (65) mit Freisetzung von Zytokinen wie Interleukin-6 (IL-6) (86, 87). Auch ist eine Interaktion zwischen TLR-4 und EGFR beschrieben (101).Des Weiteren ist bekannt, dass LPS das Tumorwachstum in vitro, ex vivo und in vivo stimuliert (108). Ob LPS jedoch direkt oder indirekt die Strahlensensitivität von NSCLC Zelllinien beeinflusst und welche Proteine und Signalwege dabei eine Rolle spielen ist noch nicht näher geklärt und wurde in dieser Arbeit untersucht.Zunächst wurden drei verschiedene NSCLC Zelllinien mit unterschiedlichem TLR-4 und EGFR Status ausgewählt. Anhand dieser sollte der Effekt von LPS auf die zelluläre Überlebensfraktion mittels Koloniebildungsassays untersucht werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die beiden Adenokarzinomzelllinien H1975 und A549, die eine mittlere bis hohe TLR-4 und EGFR mRNA Expression aufweisen, mit einer verringerten Strahlensensibilität reagieren. Die Plattenepithelkarzinom Zelllinie H520, die kaum TLR-4 und EGFR exprimiert, reagiert mit keiner veränderten Strahlenansprache auf die LPS-Behandlung.Zur Identifizierung involvierter Proteine, mittels eines Proteom Profiling Arrays, wurde die Zelllinie H1975 ausgewählt, da diese auf die LPS-Behandlung mit einer Verdopplung der Überlebensfraktion reagierte. Die Kombinationsbehandlung aus 10 Mikrogramm/ml LPS und 6 Gy zeigte im Proteom Profiling Array eine verstärkte Hochregulation des Phosphorylierungslevels der Src family kinases (SFKs) Lck, Fyn und Fgr. Die SFK Lyn zeigte dahingegen keinen so starken Anstieg des Phosphorylierungslevels im Vergleich zu Lck, Fyn und Fgr. EGFR wurde nur durch die Bestrahlung verstärkt phosphoryliert. Einen Anstieg des Phosphorylierungslevels um 200% wurde außerdem bei dem cAMP response element-binding protein (CREB) gemessen. Bei CREB handelt es sich um einen Transkriptionsfaktor, der unter anderem, die DNA-Doppelstrangbruch (DSB) Reparatur beeinflusst (51, 232, 233). Daher wurde pCREB in weiteren Versuchen indirekt durch die Inhibition des CREB binding protein (CBP) inhibiert. Zusätzlich wurde als interne Kontrolle EGFR inhibiert. Die Inhibition von CBP korreliert mit einer verstärkten Strahlensensibilität, wohingegen es nach der EGFR Inhibition nur zu einer Aufhebung der LPS-induzierten Strahlenresistenz kommt.Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die LPS-induzierte Strahlenresistenz in H1975 Zellen möglicherweise auf eine veränderte DNA-DSB Reparatur zurückzuführen ist. So korreliert eine LPS-Behandlung mit weniger residuellen gammaH2AX/53BP1 Foci nach der Bestrahlung mit 4 Gy, im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung. Dahingegen führt die CBP Inhibition zu einem signifikanten Anstieg von residuellen DNA-DSB, im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung.Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass LPS in der Lage ist, in den TLR-4 und EGFR mRNA exprimierenden Zellen H1975 und A549 eine Strahlenresistenz zu induzieren. Als möglicher grundlegender Mechanismus wurde in der Zellinie H1975 die verstärkte Phosphorylierung von CREB identifiziert. Nach der Inhibition des CBP als indirekter CREB-Inhibitor kommt es zu einer Aufhebung der Strahlenresistenz und weiter noch zu einer verstärkten Strahlensensibilität. Dieser Effekt kann auf eine verminderte Anzahl der residuellen DNA-DSB zurückzuführen sein.Die Inhibition des CREB-abhängigen Signalwegs könnte eine zukünftige therapeutische Option bei Patienten mit strahlenresistentem NSCLC darstellen. Lung cancer is the leading cause of cancer death in the western hemisphere (1), with non-small cell lung cancer (NSCLC) being the dominant histological subtype in about 85% of all cases (4).Radiotherapy is a component of tumor therapy alone or in combination with surgery or chemotherapy. Treatments like the immune therapy or targeted therapy against activating mutations of epidermal growth factor receptor (EGFR) are new strategies.NSCLC is often complicated by pulmonary infections, which appear to impair prognosis as well as therapy (61). Gram-negative bacteria are common pathogens in patients with lung cancer. Their virulence is caused the by lipopolysaccharides (LPS) (60). LPS binds to Toll-like receptor 4 (TLR-4) in pulmonary epithelial cells, leading to an inflammatory response (65) with release of cytokines such as interleukin-6 (IL-6) (86, 87). Also an interaction between TLR-4 and EGFR is described (101).Moreover, it is known that LPS stimulates the tumor growth in vitro, ex vivo and in vivo (108). However, it is unclear whether LPS directly or indirectly modulates the radiationsensitivity and which proteins and pathways are involved. This should be investigated in this work.Three different NSCLC cell lines with different TLR-4 and EGFR status were selected. Based on this, the effect of LPS on the cellular survival fraction was investigated by colony-formation assays. It was shown that the two adenocarcinoma cell lines H1975 and A549, which show a medium to high TLR-4 and EGFR mRNA expression, react with a reduced sensitivity to radiation. The squamous cell carcinoma cell line H520, which expresses only small amounts of TLR-4 and EGFR, does not respond to LPS treatment with any altered radiation response.To identify involved proteins, using a proteomic profiling array, the H1975 cell line was selected, as it responded to LPS treatment with a doubling of the survival fraction. The combination treatment of 10 microgramm/ml LPS and 6 Gy showed an increased phosphorylation level of the Src family kinases (SFKs) Lck, Fyn and Fgr in the proteom profiling array. In contrast, the SFK Lyn did not show as much increase in phosphorylation levels as Lck, Fyn and Fgr. EGFR was phosphorylated only by irradiation. An increase of the phosphorylation level by 200% was also measured in the cAMP response element-binding protein (CREB). CREB is a transcription factor that influences DNA double strand break (DSB) repair (51, 232, 233). pCREB was indirectly inhibited in further experiments by the CREB binding protein (CBP). In addition, EGFR was inhibited as an internal control. The inhibition of CBP resulted in enhanced radiosensitivity, whereas EGFR inhibition only correlates with a reversal of LPS-induced radiation resistance.Furthermore, it could be shown that LPS-induced radiation resistance in H1975 cells may be due to altered DNA-DSB repair. The LPS treatment correlates with less residual gammaH2AX/53BP1 foci after irradiation with 4 Gy compared to the sole irradiation. In contrast, CBP inhibition leads to a significant increase of residual DNA-DSB, compared to the sole irradiation.In conclusion, it has been shown that LPS is capable of inducing radiation resistance in TLR-4 and EGFR mRNA expressing cells H1975 and A549. As a possible basic mechanism, the enhanced phosphorylation of CREB was identified in the cell line H1975. After inhibition of CBP as an indirect CREB inhibitor, the radiation resistance is abolished and further increased radiation sensitivity. This effect may be due to a decreased number of residual DNA-DSB.Inhibition of the CREB-dependent signaling pathway could be a future therapeutic option in patients with radiation resistant NSCLC.