Inhibition of the influenza A virus-induced, tubulin-dependent apical mislocalization of the Na+,K+-ATPase in infected cells: Improving vectorial water transport and pulmonary edema clearance

Abstract

One of the fatal complication of influenza A virus (IAV) infection is the acute respiratory distress syndrome (ARDS) associated with sever formation of alveolar edema. Impaired resolution of pulmonary edema is a result of a direct destruction of the alveolar epithelium induced by IAV replication and an infringement of the osmotic gradient in the alveolar microenvironment, which is the main driving force of alveolar fluid clearance. IAV infection down-regulates the amount and function of several membrane ion-channels and pumps that are needed to establish the osmotic gradient.In the present work a novel mechanism of IAV pathogenicity affecting the basolateral membrane-located Na+,K+-ATPase (NKA), the major regulator of fluid homeostasis, is described. IAV infection did not reduce the overall amount of membrane-associated NKA, but induced a mislocalization of the enzyme to the apical site of infected polarized human bronchial epithelial cells (Calu3), as well as canine kidney epithelial cells (MDCK II). The mislocalization of NKA was not dependent on the IAV subtype or viral replication efficiency, but seems to be induced by IAV in general. The results of the present work indicate that the source of apically localized NKA is the vesicular intracellular NKA depot, since no decrease of NKA in the basolateral cell membrane was observed during IAV-infection, as well as inhibition of newly synthesized NKA maturation did not prevent its apical distribution. Application of the actin polymerization inhibitor cytochalasin D, the actin polymerization enhancer jasplakinolide, the inhibitor of microtubule polymerization nocodazole or the stabilizer of microtubule polymer paclitaxel, indicated that NKA mistargeting to the apical cell membrane depends on the integrity of the tubulin network. Moreover, a post-translational modification of alpha-tubulin (acetylation of residue K40), is needed for IAV-induced NKA mistargeting. This modification seems to be is indirectly regulated by Rho-kinase (ROCK) as NKA mislocalization in IAV- infected cells can be prevented by ROCK inhibition, which impairs IAV-induced caspase-3- dependent degradation of histone deacetylase 6 (HDAC6), resulting in a reduced amount of acetylated alpha-tubulin needed for apical NKA transport. In addition, ROCK inhibition not only prevented mistargeting of NKA to the apical membrane, but also reduced virus titer and restored vectorial water transport through the monolayer of highly polarized infected Calu3 cells. Application of Fasudil HCl to IAV-infected mice improved pulmonary edema clearance and reduced the virus titer and immune cell infiltration in the lungs. Taking together, an administration of ROCK inhibitors might be a potential treatment scenario for the patients with IAV-induced ARDS. Eine der gefürchtetsten Komplikationen bei einer Influenza-A-Virus (IAV)-Infektion ist die Entwicklung eines ´Akuten Atemnotsyndroms´ (ARDS), welches durch ein schweres alveoläres Ödem bedingt ist. Die Störung in der Auflösung des pulmonaren Ödems liegt zum einem in der direkten Zerstörung der Alveolarepithelzellen, bedingt durch die IAV-Replikation, und zum anderen in der Veränderung der alveolaren Mikro-Umgebung und damit in einer Störung des osmotischen Gradienten, einer der wichtigsten Faktoren zur Ödembeseitigung. Im Rahmen einer IAV-Infektion kommt es zu einer funktionellen als auch quantitativen Modulation verschiedener membranständiger Ionenkanäle bzw. pumpen, welche zur Aufrechterhaltung des osmotischen Gradient benötigt werden.In der hier vorgestellten Arbeit wird ein neuer Mechanismus der IAV-Pathogenität beschrieben, welcher die Lokalisation, der in der basolateralen Membran verankerten Natrium/Kalium-ATPase (NKA), dem Hauptregulator der Flüssigkeitshomöostase, beeinflusst. IAV-Infektion humaner Bronchialepithelzellen (Calu3) oder Hunde-Nierenepithelzellen (MDCK II) führte nicht zu einer Veränderung in der Gesamtmenge der membranständigen NKA, löste aber eine NKA-Fehllokalisation in den apikalen Membranbereich aus. Die Fehllokalisation war dabei weder vom IAV-Subtyp noch von der Effizienz der viralen Replikation abhängig, sondern scheint generell von IAV ausgelöst zu werden. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass vermutlich intrazelluläre Vesikel die Quelle der apikalen NKA darstellen, da es zu keiner Abnahme der NKA-Menge in der basolateralen Membran im Sinne einer Translokalisation kam und auch die Hemmung der NKA-Neusynthese die NKA- Fehllokalisation nicht verhinderte. Allerdings konnte durch die Hemmung der Polymerisation (Nocodazol) oder der Stabilisierung (Paclitaxel) der Mikrotubuli die apikale Fehllokalisation der NKA vermindert werden. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass eine posttranslationale Acetylierung von alpha-Tubulin ebenfalls für die Fehllokalisation notwendig ist. Diese Modifikation scheint indirekt durch die Rho-Kinase (ROCK) reguliert zu werden, da eine ROCK-Hemmung (Fasudil-HCl) die NKA-Fehllokalisation vermindert. Die ROCK-Hemmung führt zu einer Reduktion der IAV-induzierten, Caspase-3-abhängigen Degradierung der Histon- Deacetylase 6 (HDAC6). Dies wiederum führt zu einer verminderten Menge an acetyliertem Tubulin. Durch eine Hemmung von ROCK konnte aber nicht nur die NKA-Fehllokalisation in die apikale Membran reduziert werden, sondern auch der Virustiter. Gleichzeitig wurde der vektoriale Wassertransport durch hochpolarisierte, IAV-infizierte Calu-3-Zellen wiederhergestellt. Im Mausmodell führte die Behandlung mit Fasudil-HCl zu einer verbesserten Resorption des pulmonalen Ödems, einem verminderten Virustiter und zu einer Abnahme der Immunzellinfiltration der Lunge. Zusammenfassend könnte die Hemmung von ROCK eine mögliche Therapieoption für ein IAV-induziertes ARDS darstellen.