Analysing nuclear import of parvoviruses- effects of parvovirus H-1 on the nuclear envelope (NE)

Abstract

The parvoviruses are among the smallest DNA viruses, which infects the vertebrates and insects. They are divided into dependoviruses and autonomous parvoviruses. The dependoviruses depend on helper adenovirus or herpes virus to provide functions needed for their replication, whereas the autonomous parvoviruses, Parvovirus and Erythrovirus, do not need any helper virus for their DNA multiplication. Parvoviruses (PV) are non-enveloped, single stranded DNA viruses consisting of the structural proteins viral protein 1 (VP1) and VP2 and non-structural protein 1 (NS1). VP1 is the largest protein (83 kDa) contains NLS and a PLA2 activity that is not exposed on viral capsids. NS1 protein acts as a transactivator, which is covalently bound to viral DNA, and which is exposed on capsids surface. It is believed to be cleaved from the capsid upon uptake into the cells. Parvoviruses enter via clathrin-mediated endocytosis and need a low pH for productive infection. Parvoviruses exhibit 18-24 nm diameters, which is small enough to pass the nuclear pore complex (NPC) without any disassembled form. Accordingly some authors propose that NLS on VP1 that becomes exposed upon endosomal acidification mediates entry of the capsid into the nucleus. However microinjections, by passing the endosomes, generate progeny capsids being contradictory to this model. Other proposed that the PLA2 actively allows the capsids to pass the nuclear membrane, while others suggest that this activity is required for endosomal release. As the before mentioned models were based on the analysis of the autonomous parvoviruses MVM and CPV, we first evaluated whether our analysis done on parvovirus H-1 showed similar phenomenon. In fact we showed that acidification resulted in a structural change of the H-1 capsid resulting in the exposure of a NLS without leading to capsid disintegration. However nuclear entry did not occur upon infection but was shown to be caused by nuclear accumulation of progeny capsid or capsid subunits. Analysing the early steps of infection, we found that H-1 caused a local nuclear envelope breakdown (NEBD). This phenomenon was reproduced in digitonin-permeabilized cells even in the absence of cytosolic proteins. Corresponding experiments with CPV confirmed that this phenomenon was not H-1 specific. Further investigation showed that parvovirus-mediated NEBD was an enzymatically driven process involving PKC, cdk-2 and caspase-3 that are the executing enzymes in physiological NEBD upon mitosis and apoptosis. Inhibition experiments revealed that H-1 triggered NEBD by an interaction with the nuclear pores not requiring nuclear transport receptor that facilitate attachment. Infection experiments in the presence of PKC, cdk2 and caspase-3 inhibitors confirmed that all these enzymes were needed for PV-mediated NEBD upon infection. Further their inhibition blocked the appearance of progeny nuclear capsids. Further investigations revealed that PKC was however required for nuclear translocation of the progeny capsid subunits, cdk-2 for their synthesis while only caspase-3 did not affect these two steps. Indirectly these finding thus indicate that NEBD is essential for the entry of the parvoviral capsids upon infection, which is a new import principle for viruses. Parvoviren (PV) gehören zu den kleinsten Viren überhaupt. Sie infizieren Vertebraten und Insektenund werden in Dependoviren und autonome PV unterteilt. Dependoviren benötigen die Hilfe vonHerpes oder Adenoviren für Infektion oder Virusneusynthese, wohingegen die autonomen PVkeinerlei Hilfe benötigen. PV sind nicht-umhüllte einzelstränge DNA Viren, die aus den Strukturproteinen VP1 und VP2,sowie aus dem Nichtstrukturprotein NS1 bestehen. VP1 ist da größte der Proteine und enthält einKerntransportsignal (NLS), sowie eine Phosholipase A2 (PLA2) Aktivität. Beide Aktivitäten, dieauf dem N-Terminus des VP1 Proteins kodiert sind, sind jedoch nicht auf der Oberfläche derVirionen exponiert. NS1 ist ein Transaktivator, der kovalent an die Virus DNA gebunden auf derOberfläche der Viren exponiert ist. Es wird angenommen, dass dieses Protein während des Eintrittsin die Zelle abgespalten wird. PV werden über Endozytose in die Zelle aufgenommen und bedürfen eines niedrigen pH für eineproduktive Infektion. Sie weisen einen Durchmesser von 18 24 nm auf, welcher klein genug ist,um einen Transport als intakte Partikel durch die Kernporen zu erlauben. Damit übereinstimmend postulieren einige Autoren, dass das NLS, welches im Zuge derendosomalen Ansäuerung exponiert wird, den Transport des intakten Capsides in den Zellkernvermittelt. Dementgegengesetzt belegten jedoch Mikroinjektionsversuche bei denen dieAnsäuerung umgangen wird ebenfalls die Synthese von Nachkommenviren. Andere Autorenpostulierten, dass die PLA2 Aktivität die Passage der Capside durch die Kernmembran vermitteln,wohingegen wieder andere Publikationen die PLA2 Aktivität dem Freisetzen der Capside aus denEndosomen zuordnen. Da die aufgezeigten Modelle auf der Analyse der autonomen PV MVM und CPV basieren, wurdein dieser Arbeit zunächst untersucht, ob die Analysen, die mit dem PV H-1 durchgeführt wurden,übertragbar sind. Tatsächlich konnte eine pH-bedingte Strukturänderung der Viruscapsidebeobachtet werden, die eine Exposition des NLS hervorrief, ohne jedoch die Capsidstruktur zuzerstören. Dessen ungeachtet konnte jedoch keinerlei nukleärer Import der infizierenden Capside inden Zellkern beobachtet werden. Einzig die Synthese von neuen Capsiduntereinheiten führte zueiner Akkumulation dieser, oder von kompletten Capsiden im Zellkern. Während der Analyse des frühen Infektionsvorganges konnte beobachtet werden, dass dieKernmembran lokal an den Stellen desintegriert wurde, an denen PV auf der cytosolischen Seiteakkumulierten. Dieses Phänomen konnte ebenfalls in Abwesenheit cytosolischer Proteine inDigitonin-permeabilisierten Zellen beobachtet werden. Korrespondierende Experimente mit demPV CPV bestätigte, dass dieses Phänomen nicht H-1-spezifisch war. Weitere Analysen zeigten,dass die PV-vermittelte Kernmembranzerstörung (nuclear envelope break-down, NEBD) einenzymatisch katalysierter Prozess war, der PKC, Cdk 2 Kinase und Caspase 3, also dieausführenden Enzyme dieses Vorganges während Apoptose und Mitose, benötigte. Inhibitionsexperimente demonstrierten, dass der NEBD durch einen Kontakt zwischen H-1 undden Kernporen vermittelt wurde. Inhibitionen der PKC, Cdk 2 und Caspase 3 während Infektionenzeigten weiterhin, dass alle diese Enzyme auch dort den NEBD vermittelten und die Entstehungvon nukleären neusynthetisierten Capsiden verhinderten. Nähere Charakterisierungen belegtenjedoch, dass PKC den nukleären Import der Capsiduntereinheiten in den Zellkern verhinderten,Cdk-2 die Neusynthese blockierte, aber Caspase-3 weder mit Synthese oder Transport der80neusynthetisierten Intermediate interferierte. Indirekt implizieren diese Resultate also, dass derNEBD für das Eindringen der Capside in den Zellkern während der Infektion notwendig sind,welches ein völlig neues Prinzip für den Kerntransport von Viren darstellt.