Genetic and metabolomic analysis of phenolic compounds associated with Verticillium longisporum resistance in oilseed rape (Brassica napus L.)

Abstract

Verticillium longisporum ist ein bedeutendes bodenbürtiges Pathogen, das die Verticillium-Krankheit in Raps ( Rapswelke ) verursacht. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer genetischer Marker für Verticillium-Resistenz und die Aufdeckung involvierter Mechanismen und Signalwege, die ggf. zu einer Resistenzreaktion von Raps gegen V. longisporum führen. Zunächst wurde ein genetischer Ansatz verfolgt, um quantitative trait loci (QTL) und mögliche metabolische Eigenschaften der B. napus Resistenz gegen V. longisporum in einer Kartierungspopulation zu identifizieren. Im weiteren wurde die Zusammensetzung löslicher Phenole, Zellwand-gebundener Phenole und der Lignin-Fraktion aus Hypokotylen wurde mittels RP-HPLC und GC/MS untersucht. Deren Expressionsmuster, Korrelation mit der Resistenz-Ausprägung und genetische Kolokalisationen mit Resistenzloci wurden analysiert.Auf den Chromosomen C1 und C5 wurden ein Major- bzw. ein Minor-QTL für V. longisporum-Resistenz identifiziert. Des Weiteren konnte ein Zusammenhang dieser Loci mit der Expression einfacher und komplexer Phenole gezeigt werden. QTL-gekoppelte Marker wurden identifiziert, validiert und als nützlich für eine marker- bzw. metabolom-gestützte Resistenzzüchtung gegen V. longisporum bei Raps eingestuft. Korrelationsanalysen anhand von 98 DH-Linien zeigten, dass die Resistenzausprägung stark mit der Akkumulation zellwand-gebundener Phenole assoziiert ist, aber nur im geringen Ausmaß mit in der Vakuole und im Zytoplasma befindlichen löslichen Phenolen assoziiert ist. Statistische Auswertungen zeigten, dass eine Veränderung V. longisporum-induzierter Phenole und nicht der präformierten Phenole eine wichtige Rolle in der Wirt-Pathogen-Interaktion spielen. Phenole (p-Cumarsäure, Kaffeesäure), die für die Zellwand-synthese notwendig sind, Kaffesäure-Derivate (Chlorogensäure, Rosmarinsäure), Pflanzenhormone (Salizylsäure, Gentisinsäure) und glykosilierte Flavonoide (Naringin, Phlorizin) hingegen spielen zwar eine signifikante, aber doch untergeordnete Rolle für die Resistenzausprägung in Raps. Darüber hinaus konnte in dieser Studie nachgewiesen werden, dass entgegen anderen Angaben in der Fachliteratur, die Ligninmonomer-Zusammensetzung nur eine marginale Rolle bei der Resistenz gegen V. longisporum spielt. Erstmalig wird hier gezeigt, dass eine starke Assoziation zwischen Resistenzausprägung und einfachen Phenolen aus der Gruppe der Hydroxyzimtsäuren (Ferulasäure, 5-Hydroxyferulasäure und Sinapinsäure) und Hydroxybenzoesäure-Derivaten (Vanillin, Vanillinsäure, Protocatechusäure a) gegeben ist. Die Wichtigkeit dieser Verbindungen konnte durch Kolokalisation der Metaboliten-QTL mit dem Major- und Minor-Resistenz-QTL bestätigt werden. Basierend auf Metabolitenexpressionsmustern und Integration von publizierten Stoffwechselwegsdaten konnten Kandidatengene des zentralen Phenylpropanoid- und abzweigender Stoffwechselwege (4CL, F5H, CHS, UGT) als relevant für die B. napus - V. longisporum-Interaktion identifiziert werden. V. longisporum is an important soilborne pathogen causing Verticillium disease in oilseed rape. The aim of the study was to develop new markers and obtain insights into putative mechanisms and pathways involved in the V. longisporum resistance reaction in oilseed rape. A genetic approach was used to identify quantitative trait loci (QTL) for V. longisporum resistance and metabolic traits potentially influencing resistance in a B. napus mapping population. The composition of soluble phenolics, cell wall phenolics and lignin fractions from hypocotyls of the mapping populations were determined by RP-HPLC and GC/MS. Their patterns of expression, correlation with resistance expression and genetic co-localization with resistance loci were investigated in order to understand their biological relevance.A major and minor QTL for V. longisporum resistance in oilseed rape was identified on chromosomes C1 and C5 of B. napus. These loci were also found to be involved in expression of simple and complex phenolics involved in the resistance expression. QTL-linked markers were identified which were validated and shown to be useful for V. longisporum resistance breeding in oilseed rape. It was shown based on correlation analyses using 98 DH lines that resistance expression for V. longisporum is strongly associated with cell wall-bound simple and complex phenolics, but only to a limited extent with the soluble phenolics fraction (representing the cytoplasm and vacuole). Ranking of identified phenolics and tissue fractions based on statistical evaluation revealed that V. longisporum-induced changes of phenolics and not preformed phenolics play a major role in the resistance host-pathogen interaction. Phenolics involved in cell wall esterification (p-coumaric acid, caffeic acid) and their derivates such as caffeic acid esters (chlorogenic acid, rosmarinic acid), phytohormones (salicylic acid, gentisic acid) and glycosylated flavonoids (naringin and phlorizin) play a minor role in oilseed rape-V. longisporum resistance interaction. Surprisingly and contrary to common assumptions in the literature, statistical evaluation revealed that also the lignin monomer composition only plays a minor role for V. longisporum resistance. As shown for the first time, V. longisporum resistance expression in oilseed rape is, however, strongly associated with simple phenolics belonging to the group of hydroxycinamic acids (ferulic acid, 5-hydroxyferulic acid and sinapic acid) and their hydroxybenzoic acid derivates (vanillin, vanillic acid, protocatechiuc acid). The relevance of these compounds was further confirmed by co-localization of the metabolite QTL with the major and minor resistance QTL. Based on the pattern of metabolite expression and integration with published pathway data, a number of genes from the core phenylpropanoid and its branching pathways (4CL, F5H, CHS, UGT) are suggested as candidates to be involved in V. longisporum resistance of rapeseed.