Appearance of epitopes in bovine milk protein variants, their allergenicity and potential use in human nutrition

Abstract

Within the screening of milk samples from different bovine breeds, the known genetic casein variants alphaS1-CN B and C, alphaS2-CN A, B, and D, beta-CN A1, A2, and B, as well as kappa-CN A, B, and E were confirmed and used for in vitro gastrointestinal digestion analyses. The results showed that, despite the significant enzymatic hydrolysis of the alphaS1-, alphaS2-, beta-, and kappa-CN variants during gastrointestinal digestion, peptides were of sufficient size to contain intact IgE-binding epitopes or at least substantial parts thereof. Three previously identified IgE-binding epitopes in alphaS1-CN (AA 109-120, AA 123-132, and AA 173-194), 3 in alphaS2-CN (AA 1 20, AA 105-114, and AA 117-128), 6 in beta-CN (AA 45-54, AA 55-70, AA 83-92, AA 107-120, AA 149-164, and AA 167-184), and 5 in kappa-CN (AA 21-44, AA 67-78, AA 95-116, AA 111-126, and AA 137-148) survived the in vitro gastrointestinal digestion. Furthermore, it could be demonstrated that the genetic polymorphisms have an influence on the arising peptide pattern as different peptides between the alphaS1-, alphaS2-, beta-, and kappa-CN variants were found. In alphaS1-CN B and C, the 2 peptides AA 174-193 of alphaS1-CN B and AA 179-198 of alphaS1-CN C comprising the intact IgE-binding epitope AA 173-194 were determined. In alphaS2-CN B, peptide AA 1-22 and in alphaS2-CN A, peptide AA 7-29 could be detected both corresponding to the major IgE-binding epitope AA 1-20 or parts thereof. Peptides AA 59-72, AA 59-80, and AA 58-80 of beta-CN A1, A2, and B, as well as peptides AA 103-123 and AA 109-123 of beta-CN B, and AA 108-129 and AA 110-125 of beta-CN A1 and A2 contained the IgE-binding epitopes AA 55-70, respectively, AA 107-120. For kappa-CN, the IgE-binding epitope AA 137-148 survived gastrointestinal digestion within peptides AA 136-149 of kappa-CN A and E and peptide AA 134-150 of kappa-CN B. Microarray immunoassays with sera from patients (n = 7) with CMA indicated an allergenic activity of some of these digested casein fragments. This might be one explanation for the high allergenicity and sensitizations rate to the caseins despite their excellent digestibility. Major immunoreactivity was identified for peptides AA 174-193 of alphaS1-CN B and AA 179-198 of alphaS1-CN C but also for the smaller peptides AA 184-196, AA 187-199, and AA 180-193 occurring in both alphaS1-CN variants. Significant IgE-binding was further detected to the gastrointestinal digestions products AA 110-125 of beta-CN A1 and A2 as well as AA 109-123 and AA 103-123 of beta-CN B. None of the sera used in the present study reacted with any of the digestion products of the alphaS2- and kappa-CN variants. This study confirmed an influence of the genetic polymorphisms on the IgE-binding properties of epitopes from alphaS1-, alphaS2-, beta-, and kappa-CN variants of cow and revealed differences in IgE-binding to corresponding epitopes of goat and water buffalo. Single AA substitutions or deletions existing within IgE-binding epitopes AA 17-36, AA 4-23, AA 83-102, AA 173-192, and AA 175-194 of the alphaS1-CN variants A, B, C, E, and I or gastrointestinal digestion products AA 187-199, AA 174-193, and AA 178-198 of alphaS1-CN B and C, as well as AA 108-129 and AA 103-123 of beta-CN A1 and A2, respectively, B led to a loss or reduced or increased IgE-binding with a marked heterogeneity in individual sera. The modifications in the immunoreactivity mainly affected the immunodominat epitopes and, in consequence, it can be accepted that the allergenicity of the whole proteins are altered. The majority of sera showed IgE-binding to alphaS1-CN peptides of cow but also to the homologous counterparts of goat and water buffalo indicating cross-reactivity, which is due to the high degree of AA sequence homology between the milk proteins from cow and the other Bovidae. However, individual sera exhibited a lower, higher, or exclusive immunoreactivity to epitopes of alphaS1- and beta-CN from goat and water buffalo. The results of our investigations support the suggestion that genetic variants differ in their allergenic properties and might therefore provide a new approach for the identification of an alternative and suitable protein source for CMA patients. Furthermore, milk of goat and water buffalo cannot be recommended in general as substitution for cow milk in the nutrition of CMA patients. Nevertheless, the milk proteins of these species are also characterized by genetic polymorphisms, whose effects on IgE-binding and allergenicity have to be defined. Im Rahmen des Screenings von Milchproben verschiedener Rinderrassen wurden die bekannten Kaseinvarianten alphaS1-CN B und C, alphaS2-CN A, B und D, beta-CN A1, A2 und B, sowie kappa-CN A, B und E bestätigt und für in vitro gastrointestinale Verdaustudien herangezogen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Peptide, trotz der umfassenden enzymatischen Hydrolyse der alphaS1-, alphaS2-, beta- und kappa-CN-Varianten während des gastrointestinalen Verdaus, noch groß genug waren, um intakte IgE-bindende Epitope oder signifikante Teile davon zu enthalten. So überstanden 3 bereits identifizierte IgE-bindende Epitope des alphaS1-CN (AA 109-120, AA 123-132 und AA 173-194), 3 des alphaS2-CN (AA 1 20, AA 105-114 und AA 117-128), 6 des beta-CN (AA 45-54, AA 55-70, AA 83-92, AA 107-120, AA 149-164 und AA 167-184) und 5 des kappa-CN (AA 21-44, AA 67-78, AA 95-116, AA 111-126 und AA 137-148) den gastrointestinalen Verdau unverändert. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass der genetische Polymorphismus einen Einfluss auf das entstehende Peptidmuster besitzt, da unterschiedliche Peptide zwischen den alphaS1-, alphaS2-, beta- und kappa-CN-Varianten detektiert wurden. In den alphaS1-CN-Varianten B und C wurden die 2 Peptide AA 174-193 (alphaS1-CN B) und AA 179-198 (alphaS1-CN C) gefunden, die das intakte IgE-bindende Epitop AA 173-194 umfassen. Im alphaS2-CN B konnte Peptid AA 1-22 und im alphaS2-CN A Peptid AA 7-29 bestimmt werden, die beide dem IgE-bindenden Hauptepitop AA 1-20 oder Teilen davon entsprechen. Die Peptide AA 59-72, AA 59-80 und AA 58-80 der 3 beta-CN-Varianten A1, A2 und B sowie die Peptide AA 103-123 und AA 109-123 des beta-CN B und AA 108-129 und AA 110-125 des beta-CN A1 und A2 enthalten die IgE-bindenden Epitope AA 55-70 bzw. AA 107-120. Bei dem kappa-CN überstand das IgE-bindende Epitop AA 137-148 den gastrointestinalen Verdau als Bestandteil von Peptid AA 136-149 des kappa-CN A und E und von Peptid AA 134-150 des kappa-CN B. Mittels Microarray Immunoassay und Seren von Patienten (n= 7) mit CMA konnte bei einigen dieser verdauten Kaseinfragmente eine allergene Aktivität bestätigt werden, was eine Erklärung für die hohe Allergenität und Sensibilisierungsrate gegenüber den Kaseinen trotz ihrer exzellenten Verdaulichkeit sein könnte.Die Peptide AA 174-193 des alphaS1-CN B und AA 179-198 des alphaS1-CN C wiesen die stärkste Immunreaktivität auf, aber auch für die kleineren Peptide AA 184-196, AA 187-199 und AA 180-193 beider alphaS1-CN-Varianten konnte eine deutliche IgE-Bindung festgestellt werden. Des Weiteren wurde eine signifikante IgE-Bindung an die gastrointestinalen Verdauprodukte AA 110-125 des beta-CN A1 und A2 sowie AA 109-123 und AA 103-123 des beta-CN B identifiziert. Keines der verwendeten Seren reagierte mit einem der Verdauprodukte der alphaS2- und kappa-CN-Varianten. Die Ergebnisse der Microarray Immunoassays bestätigten einen Einfluss des genetischen Polymorphismus auf die IgE-bindenden Eigenschaften der Epitope der alphaS1-, alphaS2-, beta- und kappa-CN-Varianten beim Rind und wiesen zudem Unterschiede in der IgE-Bindung zu den entsprechenden Epitopen von Ziege und Wasserbüffel auf. Einzelne Aminosäuresubstitutionen oder deletionen, die innerhalb der IgE-bindenden Epitope AA 17-36, AA 4-23, AA 83-102, AA 173-192 und AA 175-194 der alphaS1-CN-Varianten A, B, C, E und I oder der gastrointestinalen Verdauprodukte AA 187-199, AA 174-193 und AA 178-198 des alphas1-CN B und C sowie AA 108-129 und AA 103-123 des beta-CN A1, A2, bzw. B auftraten, führten zu einem Verlust oder einer Abnahme oder einer Zunahme der IgE-Bindung mit deutlichen Heterogenitäten zwischen den einzelnen Seren. Die Veränderungen in der Immunreaktivität betrafen hauptsächlich die immunodominanten Epitope und folglich sind Auswirkungen auf die Allergenität des gesamten Proteins anzunehmen.Die Mehrheit der Seren zeigte eine IgE-Bindung an die Peptide des alphaS1-CN vom Rind, aber auch an die homologen Gegenstücke von Ziege und Wasserbüffel, was auf eine Kreuzreaktion hinweist, die durch den hohen Grad der Homologie in der Aminosäuresequenz zwischen den Milchproteinen des Rindes und der anderen Bovidae bedingt ist. Allerdings wiesen einzelne Seren eine niedrigere, höhere oder ausschließliche IgE-Bindung an die Epitope des alphaS1- und beta-CN von Ziege und Wasserbüffel auf.Aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen wird deutlich, dass sich die genetischen Varianten in ihren allergenen Eigenschaften unterscheiden. Sie bieten daher einen neuen Ansatz für die Identifikation einer geeigneten Proteinquelle für Patienten mit Kuhmilchallergie. Zudem kann die Milch von Ziege oder Wasserbüffel generell nicht als ein Ersatz für Kuhmilch in der Ernährung von kuhmilchallergischen Patienten empfohlen werden. Allerdings sind auch die Milchproteinvarianten dieser Tierarten durch genetische Polymorphismen charakterisiert, deren Effekte auf die IgE-Bindung und Allergenität der Proteine noch bestimmt werden müssen.