Bacterial and Fungal Microbiota of Flower Pollen and Potential Impact on Pollen-related Allergies

Abstract

Flower pollen is a plant microhabitat which was overseen for microbial analyses compared to the intensively studied leaf and root habitats. Pollen is important for plant reproduction and provides nutrients for insects e.g. for honeybees and humans such as honey and propolis. Pollen of wind-pollinated plants is a major airborne allergen all over the world, causing severe allergic rhinitis. In this work the abundance, structure and diversity of the microbiota associated with the pollen of nine different plants, including four wind-pollinated, high allergenic species (birch, winter rye, common hazel and common mugwort), four insect-pollinated, low allergenic species (autumn crocus, winter rapeseed, blackthorn and cherry plum) and one wind-pollinated but low allergic species (hemp) were compared. The microbiota was analysed by high-throughput sequencing approach based on bacterial 16S rRNA gene and fungal ITS2 region. In parallel, culture-dependent methods were used to estimate the extent of the cultivable bacterial fraction, and microscopic methods were used to visualise the colonization of bacteria on pollen grains. Furthermore, bacterial endotoxin levels (lipopolysaccharides and lipoteichoic acids) of pollen were compared with those of the bacterial isolates, by using enzyme-linked immunosorbent assay.Proteobacteria (bacteria) and Ascomycota (fungi) were the most abundant phyla, while Pseudomonas (bacteria) and Cladosporium (fungi) were the most abundant genera found in the pollen microhabitat. Archaea sequences were not detected. Furthermore, the bacterial and fungal alpha diversity indices were significantly lower in the low allergenic pollen and in hemp, compared to the high allergenic pollen. The most significant influencing factors in bacterial and fungal microbiotas were allergenic potential followed by plant species and pollination type (wind- and insect-pollinating) of the pollen. Notably, the hemp clustered closer to the other low allergenic pollen species. A core microbiome consisting of 12 bacterial and 33 fungal genera was found in the pollen of the nine plant species investigated. The most abundant core genera found were Pseudomonas and Rosenbergiella (bacteria), and Cladosporium and Aureobasidium (fungi). Co-occurrence analysis highlighted significant inter- and intra-kingdom interactions, and the interaction network was shaped by four bacterial hub taxa: Methylobacterium (two OTUs), Friedmanniella and Rosenbergiella. Methylobacterium prevailed in wind-pollinated high allergenic pollen and Rosenbergiella in the insect-pollinated low allergenic pollen; the latter was negatively correlated with the other three hubs, indicating habitat preference. For evaluation of the allergic potential of the bacterial isolates and pollen, the bacterial endotoxins level were assessed. In high allergenic pollens endotoxin concentrations were higher than low allergenic ones. Interestingly, the lipopolysaccharide concentrations of Gram-negative bacteria isolated from high allergenic pollen were also significantly higher than those of low allergic pollen isolates. The levels of endotoxins in the pollen and in the corresponding bacterial isolates were highly correlated which supports our hypothesis that pollen microorganisms may play a role in pollen allergy. In total 157 morphologically different bacterial strains, belonging to 27 bacterial families, were isolated from the nine different pollens. Among them, a new species from the genus Spirosoma was isolated from common hazel, characterized by phenotypic, phylogenetic and genotypic (draft genome sequence) variations and described as the new species Spirosoma pollinicola HA7T.This study enhances our basic knowledge of the pollen microbiome, provide insights on the role of pollen-associated microbes in pollen allergy, and poses the basis for further inter- and intra-kingdom interaction studies of the plant reproductive organs. Blütenpollen wurden bisher als Objekt für mikrobiologischen Untersuchungen übersehen, obwohl andere Pflanzenhabitate wie Blätter und Wurzeln sehr intensiv mikrobiologisch analysiert wurden. Pollen ist essentiell für die pflanzliche Reproduktion, er stellt jedoch auch Nährstoffe für viele Insekten bspw. Bienen und den Menschen als Honig oder Propolis zur Verfügung. Auf der anderen Seite wirkt der Pollen von windbestäubten Pflanzen weltweit als windgetragenes Allergen und kann schwere allergische Rhinitis verursachen.In dieser Arbeit wurde die Abundanz, Struktur und Diversität der pollenassoziierten Mikrobiota von neun verschiedenen Pflanzen analysiert: vier windbestäubte, hoch-allergene Pollen (Birke, Roggen, Hasel und Beifuß), vier insektenbestäubte, niedrig-allergene Pollen (Herbstzeitlose, Raps, Schlehe und Kirschpflaume) sowie der Hanf als eine weitere windbestäubte Art mit geringer Allergiewirkung. Für die Mikrobiota wurde die 16S rRNA Gensequenz und für die pilzliche Mikrobiota die ITS2 Sequenz mittels Hochdurchsatzsequenzierung analysiert. Zusätzlich wurde mit klassischen Kultivierungsmethoden der kultivierbare Anteil der Mikrobiota erfasst und mittels verschiedener Mikroskopie Methoden wurde die Besiedlung der Pollen mit Bakterien visualisiert. Der Endotoxingehalt (Lipopolysaccharide und Lipoteichonsäuren) von Pollen und Bakterienisolaten wurde mit enzymgebundenen immunologischen Tests (ELISA) bestimmtProteobacterien (Bakterien) und Ascomycota (Pilze) sind die häufigsten Phyla und Pseudomonas (Bakterium) und Cladosporium (Pilz) sind die häufigsten Gattungen der analysierten Pollen. Archaea Sequenzen wurden nicht gefunden. Die bakteriellen und pilzlichen alpha- Diversitätsindexe waren signifikant niedriger in niedrig-allergenen Pollen und auch im Hanf im Vergleich zu hoch-allergenen Pollen. Der am höchsten signifikant beeinflussende Faktor der bakteriellen und pilzlichen Mikrobiota war das Allergiepotential des Pollens, gefolgt von der Pflanzenart und der Bestäubungsart (wind- oder insektenbestäubt). Bemerkenswert ähnlich zu den anderen niedrig-allergenen Pollen verhielten sich Hanfpollen.Die Mikrobiota, die in allen der neun Pflanzenarten zu finden sind ( core microbiota ) bildeten 12 bakterielle und 33 pilzliche Gattungen. Die häufigsten Gattungen waren Pseudomonas und Rosenbergiella (Bakterien), sowie Cladosporium und Aureobasidium (Pilz). Die Analyse des gemeinsamen Auftretens ( co-occurrence analysis ) von Arten ermöglicht Inter- und Intrainteraktionen zwischen bakteriellen und pilzlichen Arten zu erkennen. Das Interaktionsnetzwerk wurde dominiert von vier Bakteriengattungen: Methylobacterium (zwei Gattungen), Friedmanniella und Rosenbergiella. Methylobacterium überwog in windbestäubten, hoch-allergenen Pollen, während Rosenbergiella in insektenbestäubten, niedrig-allergenen Pollen überwog. Rosenbergiella war negativ korreliert mit den anderen drei dominierenden Gattungen des Netzwerkes und zeigt die Präferenz fürs Habitat an.Zur Beurteilung des allergenen Potential der Bakterienisolate und des Pollens wurde der bakterielle Endotoxingehalt analysiert. In hoch-allergenen Pollen war der Endotoxingehalt höher als in niedrig-allergenen Pollen. Interessanterweise waren die Lipopolysaccharidkonzentrationen der Gram-negativen Bakterienisolate von hoch-allergenen Pollen ebenfalls signifikant erhöht im Vergleich zu denjenigen von niedrig-allergenen Pollen. Der Gehalt an Endotoxin im Pollen und der davon isolierten Bakterienisolaten war hoch korreliert, was die Hypothese unterstützt, dass die Pollenmikrobiota eine wichtige Rolle bei der Pollenallergie spielt.Es wurden insgesamt 157 morphologisch unterschiedliche Bakterienisolate (27 Familien) von neun verschiedenen Pollen isoliert. Darunter war eine neue Art der Gattung Spirosoma, welche von Haselpollen isoliert wurde. Dieses Isolat wurde phenotypisch, phylogenetisch und genotypisch charakterisiert und als neue Bakterienart Spirosoma pollinicola HA7T beschrieben.Mit dieser Arbeit wurde das Wissen zum Mikrobiom von Pollen verbessert und erste Hinweise für die Rolle der pollenassoziierten Mikroorganismen erhalten, welche eine Grundlage für weitere Studien zur Interaktion zwischen den Königreichen Pflanzen, Pilzen und Bakterien auf reproduktiven Pflanzenorganen darstellen.