Characterization and inhibition of NADPH-producing enzymes from the pentose phosphate pathway of Plasmodium parasites

Abstract

Malaria is one of the world s most deadly infectious diseases, mainly caused by P. falciparum (Pf) and P. vivax (Pv). Increasing resistance of Plasmodium strains against commonly used drugs endangers an effective treatment. Therefore, new antimalarial drugs need to be developed. During their life cycle, Plasmodium parasites are continuously exposed to oxidative stress, the major antioxidative systems highly depend on NADPH. For Plasmodium, the oxidative pentose phosphate pathway is the main source of NADPH, generated by two enzymes: the bifunctional glucose 6-phosphate dehydrogenase 6-phosphogluconolactonase (GluPho) and the 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD), both considered as promising drug targets. The aim of this thesis was to (further) characterize these enzymes and to investigate the potential of several small molecules as future antimalarial drug components.In PfGluPho, naturally occurring mutations have been discovered; however, in contrast to mutations in the gene for hG6PD, these mutations and the studied naturally occurring phosphorylations do not lead to major changes in the properties of the enzyme. In addition to P. falciparum, recombinant production and characterization of P. vivax G6PD are described. Notably, PvG6PD has lower activity and higher KM values for substrate and cofactor than PfGluPho, indicating that it has some functional disadvantages. Full-length PvGluPho ought to be characterized to investigate potential advantages of the fusion. However, since the recombinant production of PvGluPho is extremely challenging, the characterization of PvG6PD makes this important enzyme in the meantime accessible to drug discovery activities.Furthermore, recombinant production and kinetic characterization of Pf6PGD are described. We were able to solve the X-ray structures of native Pf6PGD as well as in complex with its substrate or its cofactor at resolutions of 2.8 Å, 1.9 Å, and 2.9 Å, respectively. With its dimeric conformation, each subunit consisting of a cofactor and a substrate binding domain, as well as a C-terminal tail threading through the adjacent subunit, the overall structure of Pf6PGD is similar to 6PGDs from other species. We could show that a flexible loop bordering the substrate binding site rearranges upon binding 6PG, thereby likely regulating the binding conformation of NADP+. Furthermore, the interaction between the Plasmodium-specific residue W104 and the conserved residue W265 was shown to play a role in the interaction between the cofactor and the substrate binding domain of the enzyme.Moreover, the impact of the post-translational modifications S-glutathionylation and S-nitrosation on the enzymes was tested. None of the enzymes were prone to S-glutathionylation, but all of them were prone to S-nitrosation. The three enzymes catalyzing the G6PD reaction were only moderately inhibited upon S-nitrosation, while the Pf6PGD activity was reversibly inhibited by up to 65%. This might protect the enzyme from irreversible nitrosative damage.All tested compounds had comparable IC50 values and mode of inhibition on PfGluPho and PvG6PD. This supports the hypothesis that it might be possible to develop a drug that effectively treats malaria caused by both species. The most promising compound was SBI-0797750 with an IC50 in the very low nanomolar range. Moreover, inhibition of hG6PD was below 50% at 99 µM as the highest concentration tested, showing the high selectivity for the plasmodial enzymes. In mode of inhibition studies, SBI-0797750 was determined to compete with the substrate for the binding site in PfGluPho. Furthermore, it effectively inhibits the growth of asexual blood stage parasites. Further characterization of SBI-0797750 with regard to its pharmacokinetic behavior is needed. An initial set of Pf6PGD inhibitors with IC50 values in the very low micromolar range was identified by screening the MMV Malaria Box. This is a promising starting point for structure-based optimization approaches. Malaria ist eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten, die meisten Fälle werden durch P. falciparum (Pf) und P. vivax (Pv) verursacht. Das vermehrte Auftreten von Resistenzen gegen gebräuchliche Medikamente gefährdet eine effektive Behandlung, die Entwicklung neuer Medikamente ist daher angeraten. Im Laufe ihres Lebenszyklus sind die Parasiten kontinuierlich oxidativem Stress ausgesetzt. Die wichtigsten antioxidativen Systeme sind von NADPH abhängig, wofür die Hauptquelle in Plasmodium der oxidative Pentosephosphatweg darstellt. Generiert wird es von zwei Enzymen, der bifunktionellen Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-6-Phosphogluconolactonase (GluPho) und der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6PGD), die beide als vielversprechende Ziele für Hemmstoffe angesehen werden. Ziel dieser Arbeit war die (weitere) Charakterisierung dieser Enzyme. Daneben wurde das Potential verschiedener Wirkstoffe als mögliche Bestandteile neuer Malariamedikamente untersucht.In PfGluPho wurden natürliche Mutationen entdeckt. Im Gegensatz zu Mutationen im Gen für hG6PD bewirken diese wie auch natürlich vorkommende Phosphorylierungen jedoch keine bedeutenden Veränderungen der Eigenschaften des Enzyms. Neben P. falciparum sind die rekombinante Herstellung und Charakterisierung der P. vivax G6PD beschrieben. PvG6PD hat eine niedrigere Aktivität und höhere KM-Werte als PfGluPho, was auf funktionelle Nachteile hindeutet. Die komplette PvGluPho sollte charakterisiert werden, um mögliche Vorteile der Fusion zu untersuchen. Da sich die rekombinante Produktion von PvGluPho als extrem herausfordernd darstellt, sichert PvG6PD in der Zwischenzeit die Verfügbarkeit dieses wichtigen Enzyms für die Medikamentenentwicklung.Daneben sind die rekombinante Herstellung und kinetische Charakterisierung der Pf6PGD beschrieben. Es ist uns gelungen, die Röntgenstruktur der nativen Pf6PGD mit einer Auflösung von 2,8 Å zu ermitteln, die Auflösungen in Komplex mit Substrat oder Cofaktor lagen bei 1,9 beziehungsweise 2,9 Å. Pf6PGD liegt als Dimer vor, jede Untereinheit besteht aus einer cofaktor- und einer substratbindenden Domäne, sowie einem C-terminalen Endstück, das durch die benachbarte Untereinheit ragt. Damit ist die Struktur den Enzymen anderer Spezies ähnlich. Wir konnten zeigen, dass eine flexible Schlaufe in der Nähe der Substratbindestelle eine neue Position einnimmt, sobald 6PG gebunden hat. Dabei wird möglicherweise die Bindungsposition von NADP+ reguliert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Interaktion des Plasmodium-spezifischen W104 mit W265 die Interaktion der beiden Domänen unterstützt.Des Weiteren wurde der Einfluss der posttranslationalen Modifikationen S-Glutathionylierung und S-Nitrosierung auf die Enzyme getestet. Keines der Enzyme war zugänglich für S-Glutathionylierung, jedoch alle für S-Nitrosierung. Während die Aktivität von PfGluPho, PfG6PD und PvG6PD nur in sehr geringem Maß durch S-Nitrosierung verringert wurde, wurde die Pf6PGD Aktivität reversibel um bis zu 65 % gehemmt. Möglicherweise werden die Enzyme so vor irreversiblen Schäden durch nitrosativen Stress geschützt.Alle getesteten Hemmstoffe zeigten eine vergleichbare Wirkung auf PfGluPho und PvG6PD. Dies unterstützt die Annahme, dass es möglich ist, einen Wirkstoff zu entwickeln, der gegen beide Plasmodien-Arten eingesetzt werden kann. Der vielversprechendste Wirkstoff war SBI-0797750 mit IC50-Werten für PfGluPho und PvG6PD im sehr niedrigen nanomolaren Bereich. Selbst bei der höchsten getesteten Konzentration von 99 µM war die Hemmung von hG6PD bei unter 50 %, womit der Wirkstoff hochselektiv für plasmodiale Enzyme ist. Hemmstudien zeigten, dass SBI-0797750 mit dem Substrat um die Bindestelle in PfGluPho konkurriert. Des Weiteren hemmt SBI-0797750 effektiv das Wachstum asexueller Blutstadien. Weitere Charakterisierung von SBI-0797750 im Hinblick auf seine pharmakokinetischen Eigenschaften wird benötigt. Daneben konnten durch das Screening der MMV Malariabox erste Inhibitoren der Pf6PGD mit einer Wirksamkeit im unteren mikromolaren Bereich identifiziert werden. Dies stellt einen vielversprechenden Ansatzpunkt für strukturbasierte Optimierungsversuche dar.