Isolierung und Anreicherung der enteroendokrinen K-Zellen aus Rattendarmmucosa

Abstract

Ziel und Gegenstand der Untersuchung Die enteroendokrinen K-Zellen sind geeignete Kandidaten zur Herstellung von b-Ersatzzellen zur Therapie des Diabetes mellitus Typ I. Daher sollten sie - amModell der Ratte - lokalisiert, isoliert und angereichert werden. Abschließend sollte die Glucose-Stimulierbarkeit der entstandenen K-Zellsuspension überprüftwerden.

Untersuchungsmethoden Die K-Zellen wurden sowohl entlang des gesamten Darms als auch entlang der Villus-Krypt-Achse immunhistochemisch durch Immunfluoreszenzfärbungen vonGefriergewebeschnitten und radioimmunologisch u.a. durch quantitative Messung des K-Zellproduktes Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP)aus Proben, die durch spezielle Schab- und Ausschütteltechniken gewonnen worden waren, mittels Radioimmunoassay lokalisiert. Anschließend wurdenMethoden zur Isolation und Anreicherung der K-Zellen entwickelt. Zur Isolation wurde der Darm kleingeschnitten und in einem hyperosmolaren,natriumcitrathaltigen Puffer inkubiert, mit dem Darmzellen schonend aus dem Zellverband gelöst werden konnten. Anschließend wurden die K-Zellen durch einhochspezifisches, immunomag-netisches Verfahren (Dynabeads, Dynal, Hamburg) stark angereichert und die Glucosestimulierbarkeit der entstandenenK-Zellsuspension überprüft.

Ergebnisse der Untersuchung Sowohl über die gesamte Darmlänge als auch innerhalb der Villus-Krypt-Achse existiert ein Verteilungsgradient: die Anzahl der K-Zellen nimmt vomproximalen Jejunum zum Ileum und von den Villi zu den Krypten hin ab. Mit dem hier entwickelten Verfahren konnten K-Zellen schonend isoliert und effektiv angereichert werden. Im Vergleich zu bisher von anderen Arbeitsgruppenmittels Elutriation durchgeführten Anreicherungsversuchen konnten durch das immuno-magnetische Verfahren mit Dynabeads K-Zellsuspensionen in einer mehrals doppelt so hohen Reinheit gewonnen werden. Es konnte gezeigt werden, daß die durch Anreicherungsversuche gewonnenen K-Zellsuspensionen auf eine Glucosestimulation (20 mmol/l) mit derAusschüttung ihres Zellprodukte Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) reagieren. Damit ist die Grundlage für die weiteren Versuche zur Herstellung von b-Ersatzzellen aus enteroendokrinen K-Zellen gelegt.