Nutzung genetischer Diversität in Raps (Brassica napus) für Assoziationsstudien zur Resistenz gegen die Wurzelhals- und Stängelfäule (Leptosphaeria maculans)

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Detektion und Nutzung von genetischen Diversität in Resistenzgen-analogen Sequenzen (RGA) und Resistenzgenkandidaten (RGC) für Assoziationsstudien bzgl. Resistenz gegenüber Leptosphaeria maculans (anamorph Phoma lingam: Phoma), dem Erreger der Wurzelhals- und Stängelfäule beim Ölraps (Brassica napus ssp. Napus L.). Diese Pilzerkrankung stellt eine der wichtigsten Krankheiten beim Raps weltweit dar. Eine quantitative Resistenz ist im aktuellen Zuchtmaterial in einer breiten Variation bezüglich L. maculans-Resistenz vorhanden, jedoch ist diese nicht näher charakterisiert. Für eine praktische Nutzung dieser quantitativen Resistenz ist die Entwicklung von effektiven Selektionsmarkern wünschenswert . In einem genomweiten Ansatz wurden RGA-Sequenzen mit Hilfe degenerierter Primer für Resistenzgenmotive (NBS, TIR, LRR) amplifiziert und sequenziert, um Locus-spezifische Primer für einzelne RGA-Loci abzuleiten. Darüber hinaus stand eine Reihe von ESTs, die bei der Abwehrreaktion von B. napus nach Phoma-Befall eine deutliche Überexpression zeigten, als potentielle Resistenzgenkandidaten zur Verfügung. Alle RGA- und RGC-Sequenzen wurden mittels Sequenz-unabhängiger Base-Excision-Sequence-Scanning (BESS-T) zur Detektion von single nucleotide Polymorphismen (SNPs) in einem Genotypen-Coreset aus 54 genetisch diversen Winterölraps-Sorten mit breiter Variation in der Phoma-Resistenzreaktion gescreent. SNPs sind die häufigste Form von genomischer Variation und können als einfacher genetischer Marker für Assoziationen zwischen der allelischen Form und dem Phänotyp genutzt werden. Sie bieten die Möglichkeit, in Sequenzen von Kandidatengenen die allelische Variation direkt aufzudecken. Durch Allel-Merkmal-Assoziationsanalysen zwischen SNP-Loci bzw. Haplotypen und dem Resistenzverhalten der Genotypen gegenüber Phoma konnten in dieser Arbeit RGA- bzw. RGC-basierte Marker identifiziert werden, die eine für die Marker-gestützte Züchtung potentiell nutzbare Assoziation mit Phoma-Resistenz aufwiesen. Einige der ermittelten Resistenzgenkandidaten stellen interessante Quellen für weitere Forschungsansätze dar, da sie in B. napus an unterschiedlichen Abwehrmechanismen, wie die hypersensitive Reaktion oder der systemisch erworbenen Resistenz, beteiligt sein könnten. Des Weiteren wurden zahlreiche SSR-Marker identifiziert, die ebenfalls eine signifikante Assoziation mit Phoma-Resistenz im Genotypen-Coreset zeigten. Viele dieser SSR-Allele wurden in B. napus bereits genetisch kartiert, so dass deren Genompositionen in Relation zu bekannten quantitative trait loci (QTL) für Phoma-Resistenz zum Teil verglichen werden konnten. In einigen Fällen kommen die Marker in Genomregionen vor, in denen signifikante Resistenz-QTL bekannt sind. Solche Marker sind daher ebenfalls aussichtsreiche Kandidaten für die Selektion auf Phoma-Resistenz und stehen nun für die Marker-gestütze Nutzung von allelischer Diversität in der Züchtung von Phoma-resistenten Rapssorten zur Verfügung The work described in this thesis aimed at detection and exploitation of genetic diversity in resistance gene candidate sequences associated with resistance to blackleg disease (Leptosphaeria maculans) in Brassica napus. Blackleg is one of the most important diseases of B. napus worldwide, with yield losses of up to 50% in epidemic years. A broad variation for L. maculans resistance is present in the B. napus gene pool, however due to the quantitative nature of the resistance it is difficult to develop effective selection markers. For practical breeding the development of effective selection markers is desirable. In a genome-wide approach, resistance gene analogue (RGA) sequences were amplified in B. napus genotypes using degenerate primers for resistance gene motifs (TIR, NBS, LRR). In addition to these anonymous sequences, further primer combinations were developed using potential resistance gene candidates (RGCs) selected from publicly available ESTs derived from the B. napus defence reaction to inoculation with L. maculans. Allele-trait association studies were performed in a core set of 54 genetically diverse winter oilseed rape genotypes showing a broad spectrum of resistance/susceptibility to blackleg disease, and verified in independent breeding lines provided by participating breeding companies. Sequence-independent SNP-detection using specific primers was carried out via base-excision sequence scanning (BESS-T). SNPs are the most abundant form of genome variation. They can be used as simple genetic markers and are suitable for detection of associations between the allelic form and the phenotype. Therefore SNPs offer the opportunity to uncover allelic variation directly within sequences of candidate genes. In this study SNP data were used for association studies with L. maculans resistance/susceptibility data from field and greenhouse tests. Cloning of RGA and RGC sequences with significant associations to resistance data allowed the development of locus-specific PCR primers for interesting genes that could potentially be involved in different pathogen defense mechanisms, including hypesensitive reactions or systemic acquired resistance. In addition to the SNP data numerous SSR markers were found to be significantly associated to blackleg resistance in the genotype corset, as well as in different verification sets provided by participating rapeseed breeders. Many of the trait-associated SSR markers have been localised previously in B. napus genetic maps, so that their positions in the genome could be compared with known quantitative trait loci (QTL) for blackleg resistance. In some cases the resistance-associated SSR markers were found to be located in genome regions containing significant resistance QTL, therefore they represent promising candidates for marker-assisted selection of blackleg resistance. The resistance-associated SNP and SSR markers are suitable for high-throughput marker assisted selection in order to broaden the gene pool of winter oilseed rape by integration of novel allelic diversity for resistance against blackleg disease.