Molekulargenetische Charakterisierung des felinen CACNA1S-Gens im Zusammenhang mit der Hypokaliämischen Periodischen Paralyse (HypoPP) der Burmakatze

Abstract

Die Hypokaliämische Periodische Paralyse (HypoPP) der Burmakatze ist eine durch generalisierte Muskelschwächen gekennzeichnete, anfallartig auftretende Erbkrankheit. Die Klärung des ursächlichen Gendefekts und die Entwicklung eines Gentests sind wichtige Voraussetzungen, um betroffene Tiere sowie Anlageträger frühzeitig erkennen und von der Zucht ausschließen zu können. Ausgehend vom klinisch vergleichbaren Krankheitsbild der HypoPP des Menschen wurde die alpha-Untereinheit des muskulären Dihydropyrin-sensitiven spannungsabhängigen Calciumionenkanals (CACNA1S) als funktionelles Kandidatengen abgeleitet. Mittels Assoziationsanalyse wurde die Beteiligung dieses Gens am Krankheitsgeschehen bei 64 Proben einer von HypoPP betroffenen Burmakatzenfamilie mit sieben erkrankten Tieren überprüft. Durch Ableitung degenerativer Primer anhand konservierter Bereiche der Gensequenzen anderer Spezies und Primerwalking wurde die komplette mRNA des felinen CACNA1S (Accession Nummer DQ128075) aus Muskelzellen isoliert. Anhand der mRNA-Sequenz wurden Primer zur Amplifikation genomischer Fragmente entwickelt. Ein DNA-Amplifikat (Accession Nummer DQ128065) wurde als Sonde zur Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in Chromosomenpräparaten eingesetzt, wodurch das CACNA1S-Gen der Katze physikalisch auf dem felinen Chromosom F1q22 kartiert wurde. Durch vergleichende Sequenzierung von fünf Amplifikaten der DNA von drei Katzen dieser Burmakatzenfamilie und einer Europäischen Kurzhaarkatze konnten insgesamt 44 genetische Polymorphismen identifiziert werden. Für den Mikrosatellit GIKA001 mit (AC)n-Motiv in Exon9 sowie die SNPs Intron17+46, Intron31+185, Intron36+482 und Exon44+188 wurden Nachweis-verfahren durch Fragmentlängenanalyse im DNA-Sequenzierautomat bzw. PCR-RFLPs entwickelt. Innerhalb der Burmakatzen traten nur drei Allele bzw. vier Genotypen des bei Katzen anderer Rassen hochpolymorphen GIKA001 auf. Die Häufigkeiten der SNP-Genotypen zwischen Burma- und anderen Katzen unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Anhand der SNPs wurden in 20 Subfamilien innerhalb der Burmakatzenfamilie die Haplotypen CCCC, TCCT und CATC identifiziert. Zwischen den Häufigkeiten bestimmter Allele der untersuchten genetischen Marker bei von HypoPP betroffenen Tieren und klinisch symptomfreien Katzen waren mit dem Fishers Exakt Test keine signifikanten Unterschiede festzustellen (p > 0,05). The hypokalaemic periodic paralysis (HypoPP) in Burmese cats is a heredity disease characterized by episodic muscle weakness. Affected animals show clinical signs of a polymyopathy associated with head nodding, neck ventroflexion and limb stiffness. The identification of the causal mutation and the development of a gene test is the prerequisite to identify both affected animals and carriers to exclude them from breeding. By using the similar disease pattern of human HypoPP as a model, the feline gene for the alpha-subunit of the dihydropyridine sensitive calcium channel CACNA1S was selected as a candidate gene putatively responsible for the HypoPP of the Burmese cats. The involvement of CACNA1S was studied by association mapping of DNA samples from 64 cats belonging to a HypoPP affected Burmese cat family. The isolation of the full-length CACNA1S mRNA was achieved by PCR with degenerated primers derived from conserved CACNA1S sequences of other species and subsequent primer walking (accession number DQ128075). Full length mRNA served as template to design primers for amplification of genomic fragments of CACNA1S. The CACNA1S gene was physically mapped on feline chromosome F1q22 by fluorescence in situ hybridization (FISH) using a genomic fragment as probe (accession number DQ128065). Comparative sequencing of three samples of the Burmese cat family and one sample of a European Shorthair led to the identification of 44 genetic polymorphisms in five amplicons. Genetic markers were developed on the basis of a fragment length analysis of the (AC)n motif microsatellite GIKA00, which is located in exon 9, and the four SNPs Intron17+46, Intron31+185, Intron36+482, and Exon44+188 using PCR-RFLPs. Despite the fact that the microsatellite GIKA001 is high polymorphic in other cats, only three alleles and four genotypes of were found in the Burmese cat family. Differences of frequencies of SNP genotypes among Burmese and other cats were significant (p < 0.05). At all 3 SNP haplotypes (CCCC, TCCT, and CATC) were identified in 20 subfamilies of the Burmese cat family. Using Fisher s exact test no significant differences between allele frequencies of genetic markers in HypoPP affected cats and animals without symptoms were found (p > 0.05).