Generation and molecular analyses of transgenic barley (Hordeum vulgare L.) in response to relevant pathogens

Abstract

In plant-pathogen interaction, both host and pathogen have evolved very sophisticated strategies to survive. Plants need to resist infection and pathogens require colonizing their hosts to attain nutrients for reproduction. Plants have evolved several mechanisms to resist pathogen invasion that consists of several defence layers. Meanwhile, nonexpressor of pathogenesis-related genes 1 (NPR1) plays in the model plant Arabidopsis an essential role in systemic resistance against pathogen infection. Previous reports and recent findings have indicated a similar function for it s homologous in rice. The significant of NPR1 in disease resistance have been proven by transient transformation of the Arabidopsis gen AtNPR1 in barley (Hordeum vulgare)-powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei, Bgh) interaction. In this respect, silencing of the NPR1 homologous gen HvNH1 using RNA interference method led to suppress NH1 transcript up to 3.7-fold at 12 hours after inoculation (hai) in challenging to Bgh. As well, in transgenic lines, the expression levels of pathogenesis-related proteins (PR-1b, PR-2 and PR-5) attenuated between 50-100% in compare to WT barley at 24 hai. The rate of susceptibility to Bgh in NH1-silenced lines increased about 29-33%. In contrary, wheat expressing AtNPR1 showed 31% increased resistance to Blumeria graminis f.sp. tritici. Histochemical observation showed suppression of hypersensitive response (HR) and cell wall apposition (CWA) by 28 and 22% in epidermal cells, respectively in NH1-silenced lines, resulted in increased fungal penetration rate. Application of systemic acquired resistance inducer, benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH) induced up to 48% resistance against Bgh in WT plants, whereas this rate in transgenic plants was only 5.5%. Therefore, BTH failed in breaking down the susceptibility to Bgh in NH1-silenced line. Consistently, MLO (Mildew resistance Locus O) as a negative cell death regulator was induced up to 63-64% more in NH1-silenced lines than in WT plants at 12 and 36 hai, respectively. However, the expression level of Bax inhibitor 1 as a cell death suppressor was not affected in NH1-silenced plant. On the other hand, NH1-silenced barley had shown no difference in susceptibility to necrotrophic pathogen Fusarium graminearum, the causal agent of barley root rot. Similarly in response to leaf spot fungus, Bipolaris sorokiniana, the rate of spore penetration associated with necrotic lesions was not significantly changed in transgenic lines in compared with WT plants at 60 hai. The described phenotypes in NH1-silenced barley are inheritable and stable in different generations. In conclusion, silencing of NH1 conferred susceptibility to Bgh but not to necrotrophic and hemibiotrophic fungi. The probable mechanisms behind Bgh susceptibility in NH1-silenced plants are MLO induction as well as suppression of PR proteins. Für Pflanze-Pathogen-Interaktionen haben beide Wechselwirkungspartnerausgeklügelte Überlebensstrategien entwickelt. Pflanzen müssen sich einer Infektion erwehren, wohingegen Pathogene ihre Wirtspflanzen erfolgreich befallen müssen um an die lebensnotwendigen Nährstoffen zu gelangen. Pflanzen haben diverse Schutzmechanismen gegen einen Pathogenbefall entwickelt. Für die systemische Resistenz gegen den Pathogenbefall spielt das Gen non-expressor of pathogenesisrelated genes 1 (NPR1) in der Modellpflanze Arabidopsis eine essenzielle Rolle. Frühere und neuste Forschungsergebnisse haben eine ähnliche Funktion für dessen Homolog in Reis gezeigt. Die Bedeutung von NPR1 für die Krankheitsresistenz konnte mit Hilfe einer transienten Transformation des Arabidopsis Gens AtNPR1 auch in der Gerste (Hordeum vulgare) - Echter Mehltau (Blumeria graminis f.sp. hordei, Bgh) Interaktion gezeigt werden. Übereinstimmend konnte in stabil transgenen Gerstenpflanzen durch eine RNA-Interferenz vermittelte Suppression des NPR1-homologen HvNH1 Gens 12 Stunden nach der Inokulation (hai) mit Bgh eine 3.7-fache Unterdrückung der NH1 Transkripte gezeigt werden. Ebenfalls konnte nach einer 24-stündigen Inokulation gezeigt werden, dass sich das Expressionsniveau derpathogenesis-related Proteine (PR-1b, PR2 und PR-5) in den transgenen Linienzwischen 50-100% im Vergleich zu der Wildtyp- (WT) Gerste bewegte. In den NH1-unterdrückten Linien konnte eine 29-33%ige Anfälligkeitszunahme gegen Bghfestgestellt werden. Im Gegensatz dazu zeigte AtNPR1 exprimierender Weizen eine um 31% erhöhte Resistenz gegen Blumeria graminis f.sp. tritici. HistochemischeBeobachtungen an den NH1-unterdrückten Linien wiesen eine Suppression derhypersensitiven Reaktion (HR) und von Zellwand Appositionen (CWA) in der Höhevon 28 und 22% in den epidermalen Zellen auf, die in einer erhöhten pilzlichenPenetration resultierten. Durch die Anwendung eines Induktors für die systemischerworbene Resistenz, benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic Säure S-Methylester(BTH), wurde in den WT Pflanzen eine 48%ige Resistenzerhöhung gegen Bgh erzielt,wobei diese Erhöhung in den transgenen Pflanzen nur 5.5% betrag. Demzufolge konnte BTH in den NH1-unterdrückten Linien nur eine geringe Anfälligkeitsminderung gegen Bgh hervorrufen. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass die Expression des Gens MLO (Mehltauresistenz Locus O) als ein negativer Zelltodregulator bis zu 63-64% höher nach 12 und 24 hai in den NH1-unterdrückten Linien induziert war als in den WTPflanzen. Jedoch war in den NH1-unterdrückten Pflanzen das Expressionsniveau vonBax Inhibitor 1 als Zelltodsuppressor nicht beeinflusst. Auf der anderen Seite zeigten die NH1-unterdrückten Gerstenpflanzen keinen Unterschied in der Anfälligkeit gegen das nekrotrophe Pathogen Fusarium graminearum, das als kausaler Erreger der Wurzelfäule bei Gerste bekannt ist. Ähnliche Ergebnisse gab es mit dem Erreger der Braunfleckigkeit, Bipolaris sorokiniana. Hierbei gab es zum Zeitpunkt 60 hai in der mit nekrotischen Lessionen verbundenen Sporenpenetrationsrate keinen signifikanten Unterschied zwischen den transgenen und WT Pflanzen. Die beschriebenen Phänotypen von der NH1-unterdrückten Gerste sind vererbbar und stabil über mehrere Generationen. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die Unterdrückung des NH1 Gens Anfälligkeit gegen Bgh verursacht aber nicht gegen nekrotrophe und heminekrotrophe Pilze. Die wahrscheinlichen Mechanismen der beobachteten Bgh-Anfälligkeit in den NH1-unterdrückten Pflanzen beruhen auf der MLO Induzierung wieauch auf der Unterdrückung der PR-Proteine.