Genetische und molekulare Untersuchungen antinutritiver phenolischer Inhaltsstoffe (Tannine) der Rapssaat (Brassica napus L.)

Abstract

Das wesentliche Ziel der Arbeit bestand darin, genetische und chemische Untersuchungen zu antinutritiven phenolischen Verbindungen im Rapssamen, hauptsächlich kondensierten Tanninen, durchzuführen. Damit sollten gegebenenfalls Zusammenhänge zwischen der Samenfarbe und phenolischen Substanzen im Hinblick auf eine verbesserte Qualität des Rapsschrotes festgestellt werden. Als Untersuchungsmaterial stand die doppelhaploide (DH) Winterrapspopulation YE2 mit 166 DH-Linien zur Verfügung. Mit Hilfe von 141 AFLP- und 50 SSR-Markern wurde eine genetische Karte für die DH-Population entwickelt, die 19 Kopplungsgruppen mit einer genetischen Gesamtgröße von 1171 cM umfasst. Die eher schwache Korrelation zwischen Samenfarbe und Proanthocyanidingehalt führt zu der Schlussfolgerung, dass die Gelbsamigkeit allein nicht als Selektionsmarker für eine Reduktion des Proanthocyanidin- oder Gesamtflavonoidgehaltes verwendet werden kann. Mit den HPLC-Messwerten der DH-Population YE2 konnten ebenfalls relevante QTL für die verschiedenen Flavonoid-Komponenten bzw. für die Flavonoide insgesamt aufgedeckt werden. Dabei konnten neben Loci, die mit signifikanten QTL für Samenfarbe in dieser Kreuzung kolokaliseren, auch verschiedene QTL lokalisiert werden, die vermutlich in Verbindung mit farblosen Flavonoiden stehen und daher unabhängig von der Samenfarbe einen ernährungsphysiologisch relevanten Einfluss auf die Flavonoidzusammensetzung haben. Auf Chromosom N9 kolokalisieren zwei Loci für F1PA2 (Sinapoylglucose) und F1PA3 mit dem Haupt-QTL für Samenfarbe mit weiteren QTL für ADF-, NDF- und ADL-Gehalte sowie einem QTL mit geringem Effekt auf den Flavonoidgehalt. Im Hinblick auf die Züchtung zur Verbesserung der Rapsschrotqualität ist dieses Ergebnis signifikant, denn hiermit wird eine Assoziation zwischen der Dicke der Samenschale mit den Gehalten an phenolischen Säuren und anderen antinutritiven Substanzen belegt. Durch eine markergestützte Selektion in Bezug auf diesen Lokus könnte ggf. unabhängig von der Samenfarbe eine wesentliche Reduktion der Gehalte an Phenolsäuren und Faserkomponenten im Rapsschrot erreicht werden. Die Ergebnisse von HPLC-Untersuchungen auf mono- und oligomerische PAs lassen erkennen, dass die Rapsmehlextrakte keine monomerischen Proanthocyanidine in nachweisbaren Mengen beinhalten. Bei einigen dunkelsamigen DH-Linien wurde interessanterweise festgestellt, dass die Samengehalte an oligomeren PAs sehr niedrig und somit vergleichbar mit den Gehalten in gelben Samen sind. Diese Beobachtungen bestätigen die Existenz von genetischer Variation für Samenzellwanddicke und assoziierte Komponenten, welche die Samenfarbe und Rapsmehlqualität in dunkelsamigen B. napus-Formen beeinflussen. Diese Ergebnisse zeigen, dass in dunkelsamigen Linien der DH-Population eine große Variation für phenolische Substanzen existiert. Somit kann man auch unabhängig von der Samenfarbe Selektionsfortschritte bzgl. Schrotqualität erwarten. Wegen seiner Rolle in der Regulierung der Samenschalenentwicklung sowie der Flavonoid-Biosynthese ist tt1 ein wichtiges Kandidatengen für Samenfarbe und assoziierte Schrotqualitätsmerkmale in Raps. Die vorläufigen QTL- und Spaltungsdaten für phenolische Verbindungen lassen vermuten, dass die Vererbung dieser Merkmale in verschiedenem B. napus Material unterschiedlich ist, wobei aber ein einzelnes, dominantes Gen eine Hauptrolle bezüglich der Verringerung einiger Inhaltsstoffe spielt. Auf Chromosom N11 konnten an gleicher Position mit dem SSR-Marker tt1_1 hochsignifikante QTL für F1PA1-, F1PA2-, Flavonoid- und Proanthocyanidin-Gehalte lokalisiert werden. Ferner finden sich in unterschiedlichen Abständen von 4 cM bis 12 cM auch QTL für Samenfarbe, Öl-, F2PA2-, F2PA3 und F3PA4-Gehalte. Dies deutet darauf hin, dass der SSR-Marker mit einer Kopie des Gens tt1 in der DH-Population YE2 gekoppelt sein könnte. Aus der Kartierungsposition des Markers lässt sich eine schwache Assoziation zur Samenfarbe in B. napus ableiten, da keine direkte Kopplung mit dem Samenfarbe-QTL auf Chromosom N11 nachweisbar war. Die gleiche Position des tt1_1-Markers mit den genannten QTL deutet auf eine mögliche direkte Beteiligung des tt1-Gens bei der Ausbildung der Endotheliumzellen und einen indirekten Einfluss des Genprodukts auf die Anreicherung von Proanthocyanidinen hin. Die Ergebnisse dieser Studie bilden die Grundlage für eine markergestützte Züchtung zur Erzeugung hellsamiger Winter-Ölrapssorten mit verbesserter Schrotqualität. Dies ist sowohl in Hinblick auf eine Verwendung des Pressrückstandes als Futtermittel als auch als Basis für die Gewinnung von hochwertigen Protein-Isolaten und Konzentraten für die Tier- und Humanernährung relevant. Die eng mit der Samenfarbe und den phenolischen Verbindungen gekoppelten molekularen Marker, die in dieser Studie identifiziert wurden, können wertvolle Werkzeuge für die Züchtung neuer hell- bzw. gelbsamiger Genotypen mit reduzierten Gehalten an antinutritiven Substanzen darstellen. The objective of this work was to perform genetic and chemical analyses of antinutritive phenolic compounds in rapeseed (principally condensed tannins). Using this analysis, the relationship between seed color and phenolic compounds in B. napus was investigated with a view to improving the rapeseed meal quality. Using the software JoinMap 3.0 a dense genetic map was generated from the DH mapping population YE2 with 166 doubled-haploid (DH) lines derived from a cross between an inbred line of the black-seeded German winter oilseed rape cultivar "Express" and the true-breeding, yellow-seeded line "1012-98", both with 00-seed quality. A total of 176 polymorphic markers (126 AFLP and 50 SSR- markers) covering 1171 cM were localized in the genetic map from the YE2-DH population. The week correlation between seed color and total PA content leads to the conclusion that the yellow seed coat color alone cannot be used as a selection marker for a reduction of total PA or flavonoid content. Using quantitative data obtained by HPLC analysis it was possible to detect QTL for total and individual flavonoid compounds. In addition to some loci that co-localized with significant QTL for seed color in this population, a number of seed colour-independent QTL for different phenolic substances were detected. These loci presumably represent genes involved in biosynthesis of colorless flavonoids, and therefore exert a nutritionally effect on the flavonoid composition independently of the seed colour.On chromosome N9 two loci for F1PA2 (presumably sinapoylglucose) and F1PA3 co-localize with the main QTL for seed color (part. R2 = 40.9%) and additionally with QTL for total flavonoid compounds, ADF, NDF and ADL content. In terms of breeding for rapeseed meal quality improvement this result is significant because it demonstrates an association between the seed coat thickness, the concentrations of phenolic acids and other antinutritive compounds. Using marker assisted selection (MAS) with respect to this locus it could be possible to obtain a significant reduction of phenolic acids and fiber components in rapeseed meal independently of the seed color.The HPLC studies of mono- and oligomeric PAs showed that the crude extract from rapeseed meal contains no monomeric proanthocyanidins (PAs) in detectable quantities. Interestingly, some DH lines with dark seed coats possessed low oligomeric PA contents comparable with the levels found in yellow seeds. These observations confirm the existence of genetic variation for seed cell wall thickness and associated traits influencing seed color and rapeseed meal quality in dark seeded B. napus. In dark seeded DH lines from the YE2-DH population a large variation of phenolic compounds was observed, therefore a selection regarding meal quality can be made independently of the seed color.Because of its role in the regulation of seed coat development and flavonoid biosynthesis the tt1 gene is an important candidate gene for seed color and associated quality traits in canola meal. The preliminary QTL and segregation data for phenolic compounds suggest that the inheritance of these traits in B. napus is different, but a single, dominant gene has an important role relating the reduction of these antinutritive compounds. Highly significant QTL for F1PA1, F1PA2, total flavonoid and total PAs content were co-localized at the same position as the SSR marker tt1_1 on chromosome N11, and QTL for seed color, oil-, F2PA2-, F2PA3- and F3PA4 content were also found nearby. This indicates that this SSR marker, and possibly a physically linked B. napus copy of the tt1 gene, could be responsible for variation in these traits in the YE2-DH population. From the mapping position of the SSR marker only a weak correlation with seed color in B. napus can be explained, because there was no direct connection with the seed color QTL on chromosome N11. The co-localization of the tt1_1 marker with the above named QTL suggests a possible direct effect of the tt1 gene on the formation of endothelial cells and an indirect impact of the gene product on enrichment with proanthocyanidins.A marker-assisted breeding strategy based on the results of this study could accelerate the generation of pure-breeding, light-colored winter rapeseed varieties with improved meal quality - both in respect to a utilization of seed meal as animal feed or as a basis for the extraction of highly nutritious protein for animal diet and human nutrition. Closely linked molecular markers that were identified during this study to the seed color and phenolic compounds can be valuable tools for breeding of new yellow or dark seeded genotypes with reduced levels of antinutritive compounds. Potential candidate genes, e.g. Bntt1, could play an important role in this direction.