Chemopreventive and sensitizing effects of phytochemicals in a cell culture model of colorectal cancer

Abstract

Sulforaphan (SFN), ein natürlich vorkommendes Isothiocyanat, dasvorwiegend in Kreuzblütlern zu finden ist, gilt aufgrund seiner potenten antikanzerogenenWirkung als effektive, chemopräventiv wirkende Substanz. In früherenStudien konnte über eine Modulation des Polyaminstoffwechsels, insbesondereüber eine Hemmung der biosynthetischen Ornithin Deacarboxylase(ODC), eine Hemmung des Zellwachstums in kolorektalen Karzinomzellen beobachtetwerden. Ein Ziel unserer Arbeit war es daher, eine mögliche Sulforaphan-vermittelte Regulation der ODC sowie die Rolle des Transforminggrowth factor-beta (TGF-beta) in der SFN-induzierten Zellproliferationshemmung inKolonkarzinomzellen näher zu charakterisieren.In der Behandlung solider Tumore limitieren sowohl die Ausbildung von Resistenzenals auch die Toxizität der chemotherapeutischen Substanzen den Erfolgder Therapie. Ein kombinierter Einsatz sekundärer Pflanzenstoffe mit konventionellenChemotherapeutika könnte durch synergistische Effekte auf verschiedeneSignaltransduktionswege sowohl eine Steigerung der antikarzinogenenWirkungen, sowie eine Verminderung von Chemoresistenzen bewirken. Resveratrolist ein natürlich vorkommendes Polyphenol, das vorwiegend in Trauben,Erdnüssen und Rotwein zu finden ist. Neben kardioprotektiven und antiinflammatorischenWirkungen werden Resveratrol auch verschiedene chemopräventiveund chemotherapeutische Eigenschaften zugesprochen. Ein weiteresZiel war es daher, mögliche synergistische Wirkungen von Sulforaphan undResveratrol in Kombination mit Oxaliplatin in Kolonkarzinomzelllinien genauerzu charakterisieren.Sulforaphan [1-50myM] hemmte konzentrationsabhängig Zellwachstumund -proliferation in Caco-2-Zellen. Weiterhin führte die Inkubationmit SFN zu einer dosisabhängigen Verminderung von ODC-Protein und -Aktivität nach 24 h, was eng mit den antiproliferativen Wirkungen korreliert. Zudemverminderte SFN sowohl die Proteinlevel als auch die Transaktivierungdes Transkriptionsfaktors c-myc, der durch Bindung an eine spezifische DNASequenzdie ODC direkt reguliert. Eine Beteiligung des TGF-beta Signalwegeskonnte durch die Zugabe des TGF-beta Rezeptor Kinase Inhibitors SB431542, derdie SFN vermittelten Wirkungen auf ODC und Zellwachstum weitestgehendaufgehoben hat, weiter bestätigt werden.Des Weiteren hemmten SFN und Res in Kombination mit Ox synergistisch dasZellwachstum in Caco-2 Zellen. Nach kombinierter Behandlung mit SFN/Oxoder Res/Ox konnten zudem ausgeprägte morphologische Veränderungen, u.a.reduzierte ATP-Level, Caspase-3-Aktivierung und DNA Fragmentierung, dietypischerweise im Zusammenhang mit Apoptose auftreten, beobachtet werden.Weiterhin konnte neben einer apoptotischen auch eine gesteigerte nekrotischeZellpopulation nachgewiesen werden, die im Falle von Resveratrol mit einersignifikant reduzierten Ausschüttung des anti-inflammatorischen Interleukin-10einhergeht aus humanen Makrophagen. Ergänzend zeigten weder Sulforaphannoch Resveratrol in Kombination mit Oxaliplatin zytotoxische Effekte in nichttransformiertemZellen.Die vorliegenden Daten zeigen erstmals, dass SFN seineantikanzerogenen Effekte, zumindest teilweise, über die Hemmung der ODCvermittelt. Dabei scheint die TGF-beta-Signalkaskade eine regulatorische Schlüsselrolleeinzunehmen. Weitere Daten lassen darauf schließen, dass SFN undRes in Kombination mit Oxaliplatin synergistisch das Zellwachstum von Kolonkarzinomzellendurch Apoptose-Induktion hemmen. Diese in vitro Daten weisenauf potente chemopräventive und -therapeutische Eigenschaften der sekundärenPflanzeninhaltsstoffe Sulforaphan und Resveratrol hin, wodurch diese vielversprechendeSubstanzen in der Entwicklung neuer Therapiekonzepte in derBehandlung des kolorektalen Karzinoms darstellen. Sulforaphane (SFN), a naturally occuring isothiocyante present incruciferous vegetables, is an attractive target due to its wide range of biologicaland pharmacological properties. In addition to anti-inflammatory activities, potentchemopreventive effects of SFN in various carcinogenesis models are describedwhereas the underlying molecular mechanisms remain partially unknown.Previous studies could demonstrate that modulation of polyamine metabolismprovides a chemopreventive strategy of different phytochemicals. Inhibitionof the biosynthetic key enzyme ornithine decarboxylase (ODC) is associatedwith reduced cell growth in several human cancers. Thus, one aim of thiswork was to elucidate a possible regulation of ODC by sulforaphane and to furtherspecify a possible role of the transforming growth factor-beta (TGF-beta)-signaling pathway.Chemotherapy plays an important role in the overall treatment of colorectalcancer but the effectiveness is often limited by tumor drug resistance and severeside effects. Thus, the use of natural agents in combination with traditionalchemotherapeutic drugs is a promising strategy for enhancing the therapeuticoutcome. Due to their anticarcinogenic properties and their low toxicity, multiplephytochemicals may serve as potent agents for enhancing the therapeutic effectof classical chemotherapeutics. Resveratrol (Res), a natural occurring polyphenolpresent in red wine, peanuts and grapes, has been reported to exhibit awide range of biological and pharmacological properties. In addition to cardioprotectiveand anti-inflammatory effects, also chemopreventive as well aschemosensitizing activities of Res in various carcionogenesis models are described.Therefore, another aim of this work was to investigate whether the isiothiocyantesulforaphane and the polyphenol resveratrol may potentiate theantitumor activities of the common chemotherapeutic oxaliplatin (Ox) in a cellculture model of colorectal cancer.SFN [1-50mymol/L] inhibites cell growth of Caco-2 cells in a dose- andtime-dependent manner, which closely correlates with a dose-dependent reductionof ODC protein expression and activity after 24 h of incubation. This effectseems to be due to reduced protein levels and transactivation activity of transcriptionfactor c-myc, a direct regulator of ODC expression, as a consequenceof SFN-induced TGF-beta/Smad signaling. The coherency of these results wasfurther confirmed by using TGF-beta receptor kinase inhibitor SB431542, whichlargely abolished inhibitory effects of SFN on both, ODC enzyme activity andtumor cell growth. Moreover, SFN, Res and Ox alone inhibited cell growth ofCaco-2-cells in a dose-dependent manner, an effect, which could be synergisticallyenhanced, when cells were incubated with the combination of SFN/Ox orRes/Ox. Co-treated cells further displayed distinctive morphological changesthat occurred during the apoptotic process, such as cell surface exposure ofphosphatidylserine, membrane blebbing as well as the occurence of cytoplasmichistone-associated DNA fragments. Further observations thereby pointedtowards simultaneous activation of both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.With increasing concentrations and treatment duration, a shift from apoptoticto necrotic cell death could be observed. Furthermore, cytotoxic effects ofRes and Ox led to an altered cytokine profile of co-cultured macrophages. Inaddition, combinatorial treatment did not affect normal cells as cytotoxicity wasnot detected in human foreskin fibroblasts and in human platelets.On the basis of these findings, diet-derived sulforaphane downregulatedODC expression and activity in colorectal cancer cells, whereby activationof the TGFbeta signaling pathway seemed to play a pivotal role. Since eleVIvated ODC enzyme activity is associated with enhanced tumor development,SFN thus may be a dietary phytochemical with potential to prevent carcinogenesis.Moreover, sulforaphane as well as resveratrol enhanced oxaliplatin-induced cellgrowth inhibition via induction of different modes of cell death without damagingnon-transformed cells. In addition, resveratrol also showed the peculiarityto abrogate immunosuppressive properties of oxaliplatin-treated cells. Dueto these results both phytochemicals show great chemopreventive and therapeuticpotential in the treatment of colorectal cancer.