Ovine milk proteins : DNA, mRNA, and protein analyses and their associations to milk performance traits

Abstract

Isoelectric focusing was applied for screening milk protein variants in milk samples from 1,078 animals of six different sheep breeds (Black Faced Mutton sheep, East Friesian Dairy sheep, Gray Horned Heath, Merinoland sheep, Merino Mutton sheep, and Rhön sheep). The known genetic variants of αs1-casein (CN; CSN1S1A, C, D), αs2-CN (CSN1S2A, B), and β lactoglobulin (LG; LGBA, B, C) were confirmed. CSN1S1C was predominant in all breeds with frequencies of 0.90 to 1.00. CSN1S2A accumulated in Gray Horned Heath, Merinoland, Merino Mutton, and Rhön sheep (0.73 to 0.93), whereas CSN1S2B was most frequent in Black Faced Mutton and East Friesian Dairy sheep. Within β-LG LGBA was predominant in all breeds with frequencies of 0.54 to 0.80, whereas LGBC showed breed specific distribution within the Merino breeds. Furthermore, the patterns of αs1-CN X were also detected in East Friesian Dairy sheep and named αs1 CN H. One and two additional patterns were identified within αs1-CN (I) and αs2 CN (C and D), respectively. All animals analysed were monomorph for κ-casein and α lactalbumin.In addition, isoelectric focusing identified seven αs1-/αs2-CN-haplotypes within the breeds analysed, while haplotypes CA and CB were most frequent. Continuative biochemical and molecular genetic analyses of CSN1S1 confirmed the occurrence of variants H and I, both caused by alternative splicing events. Within CSN1S1H skipping of exon 8 is caused by a deletion and an insertion within DNA sequence of exon 8 (g.739_742delAAGGinsTTATTTTAATAAA). Additionally, three SNPs both in intron 6 and in intron 7 were identified by DNA sequence analyses, whereas one of the latter ones (g.656T>A) caused an alternative splicing event in CSN1S1I by disrupting the donor splice site of intron 7.CSN1S2C and D are both due to different single nucleotide polymorphisms within exon 7, leading to amino acid exchanges p.Val45Ile and p.Ala48Ser in αs2-CN C and p.Arg46Ser in αs2-CN D, associated with a SNP in exon 2 in both variants. Molecular genetic analyses of CSN1S2 revealed a further variant G, caused by a non-synonymous SNP in exon 15 (p.Arg161His), and a sub form of CSN1S2A, namely A , due to a synonymous A>C mutation in exon 10. Additionally, one SNP both in exon 17 and exon 18, ten SNPs in total in introns 1, 2, 6, and 7, as well as three intron insertions were identified. The biochemical and molecular genetic results were used to postulate nomenclature for ovine CSN1S1 and CSN1S2 variation. Denomination of the new variants was carried out considering known polymorphisms and their names. In CSN1S2 we defined also already described but not named variants with CSN1S2E and F. DNA tests were established for CSN1S1 variants H and I, as well as for CSN1S2B, C, D, and G, allowing to type sheep independent of age, lactation, and sex. Additionally, association studies were established between milk protein variants and milk production traits in East Friesian Dairy sheep concerning milk protein genotypes and casein haplotypes. Significant positive associations between αs1-CN CH and fat percentage and yield, between αs2-CN AB and protein yield, and between β-LG AA and fat and protein percentage of sheep milk were identified. Furthermore, αs1-/αs2-CN-haplotype HB was associated with the highest fat and protein percentage and yield, respectively. Die isoelektrische Fokussierung wurde genutzt, um Milchproteinvarianten in Milchproben von 1078 Tieren sechs verschiedener Schafrassen (Schwarzköpfiges Fleischschaf, Ostfriesisches Milchschaf, Graue Gehörnte Heidschnucke, Merinolandschaf, Merinofleischschaf und Rhönschaf) zu bestimmen. Die bekannten genetischen Varianten im αs1-Kasein (CN; CSN1S1A, C, D), αs2-CN (CSN1S2A, B) und im β-Laktoglobulin (LG; LGBA, B, C) wurden bestätigt. CSN1S1C war in allen Rassen die häufigste Variante mit Allelfrequenzen von 0,90 bis 1,00. CSN1S2A trat gehäuft in den Rassen Graue Gehörnte Heidschnucke, Merinoland-, Merinofleisch- und Rhönschaf auf (0,73 bis 0,93), wobei CSN1S2B in den Schwarzköpfigen Fleischschafen und den Ostfriesischen Milchschafen überwog. Innerhalb des β-LG war LGBA mit Frequenzen von 0,54 bis 0,80 in allen Rassen vorherrschend und LGBC zeigte ein rassespezifisches Vorkommen in den Merinorassen. Außerdem wurden in Ostfriesischen Milchschafen die Banden des αs1-CN X nachgewiesen und als αs1-CN H bezeichnet. Ein beziehungsweise zwei neue elektrophoretische Bandenmuster wurden im αs1-CN (I) und im αs2-CN (C und D) identifiziert. Alle untersuchten Tiere waren monomorph für κ-Kasein und α-Laktalbumin.Des Weiteren führte die isoelektrische Fokussierung zur Identifizierung von sieben αs1 /αs2 CN-Haplotypen innerhalb des beschriebenen Tiermaterials, wobei die Haplotypen CA und CB vorherrschend waren. Weiterführende biochemische und molekulargenetische Analysen des CSN1S1 bestätigten das Vorkommen der Varianten H und I, die beide durch alternatives Spleißen bedingt sind. Innerhalb des CSN1S1H ist das Skipping des Exons 8 durch eine Deletion und eine Insertion innerhalb der DNA-Sequenz des Exon 8 begründet (g.739_742delAAGGinsTTATTTTAATAAA). Zusätzlich wurden durch DNA- Sequenzanalysen je drei SNPs im Intron 6 und im Intron 7 detektiert, wobei einer der letztgenannten (g.656T>A) das alternative Spleißen im CSN1S2I begründet, indem er die Donor-Spleißseite des Intron 7 zerstört. CSN1S2C und D sind beide durch unterschiedliche Einzelbasenaustausche innerhalb des Exon 7, die zu den Aminosäureaustauschen p.Val45Ile und p.Ala48Ser im αs2-CN C und p.Arg46Ser im αs2-CN D führen, gekennzeichnet und die in beiden Varianten mit einem SNP im Exon 2 assoziiert sind. Molekulargenetische Analysen des CSN1S2 identifizierten zusätzlich eine weitere Variante G, die durch einen nicht-synonymen SNP im Exon 15 (p.Arg161His) bedingt ist, und eine als CSN1S2A bezeichnete Unterform des CSN1S2A, die durch eine synonyme A>C Mutation im Exon 10 begründet ist. Weiterhin wurden in den Exons 17 und 18 jeweils ein SNP und in den Introns 1, 2, 6 und 7 insgesamt zehn SNPs, sowie drei Intron-Insertionen gefunden. Die biochemischen und molekulargenetischen Ergebnisse wurden genutzt, um die Nomenklatur für die ovinen CSN1S1 und CSN1S2 Varianten zu definieren. Die Bezeichnung der neuen Varianten erfolgte unter Berücksichtigung bekannter Polymorphismen und deren Namen. Im CSN1S2 definierten wir außerdem bereits beschriebene aber nicht benannte Varianten mit CSN1S2E und F. Unter Verwendung der identifizierten DNA Polymorphismen wurden sowohl für die CSN1S1 Varianten H und I, als auch für CSN1S2*B, C, D und G DNA-Tests entwickelt, die eine Typisierung der Schafe, unabhängig von Alter, Laktation und Geschlecht ermöglichen.Zusätzlich wurden in Ostfriesischen Milchschafen unter Einbeziehung von Milchproteingenotypen und Kasein-Haplotypen Assoziationsstudien zwischen Milchproteinpolymorphismen und Produktionsmerkmalen durchgeführt. Es wurden signifikant positive Assoziationen zwischen dem αs1-CN Genotyp CH und Fettgehalt und menge, sowie zwischen αs2-CN AB und Proteinmenge und zwischen β-LG AA und Fett- und Proteingehalt der Schafmilch identifiziert. Zudem war der αs1-/αs2-CN-Haplotyp HB mit dem höchsten Fett- und Proteingehalt sowie mit der höchsten Fett- und Proteinmenge assoziiert.