Untersuchungen zur Rolle der sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) in der Regulation von Genen der Schilddrüsenhormonsynthese

Abstract

Die vorliegende Arbeit diente der Erforschung neuer Regulationsmechanismen der Schilddrüsenhormonsynthese unter Beteiligung von SREBPs (sterol regulatory element- binding proteins). Bisher ist es allgemein bekannt, dass diese Transkriptionsfaktoren die Expression von Genen induzieren, die für Proteine der Cholesterol- und Lipidsynthese codieren. Sie werden als inaktive Vorstufen (Precursor) gebildet und in Abhängigkeit von der intrazellulären Cholesterolkonzentration aktiviert. Ziel war es, die Expression von SREBP-1c und -2 auf Transkript- und Proteinebene sowie ihre Aktivierbarkeit und Funktionalität in der Schilddrüse erstmalig zu belegen. Darüber hinaus sollten die Gene NIS (Natrium-Iodid-Symporter) und TPO (Thyroperoxidase), die eine große Rolle für die Hormonsynthese spielen, als mögliche Zielgene der SREBPs identifiziert werden. Außerdem sollte der Einfluss einer PPAR alpha-Aktivierung (peroxisome proliferator-activated receptor alpha) auf die Genexpression der SREBPs und die Schilddrüsenhormonsynthese untersucht werden. Für die Untersuchungen wurden FRTL-5-Zellen und primäre porcine Thyreocyten genutzt. Neben den relativen mRNA-Konzentrationen von SREBP-1c und -2, ihren Zielgenen sowie NIS und TPO wurden auch die relativen Proteinkonzentrationen der SREBPs sowie des NIS im Western Blot untersucht.Es wurde untersucht, ob die Expression der SREBPs durch TSH über die cAMP- Kaskade induziert wird. TSH ist der primäre Stimulus für Schilddrüsenwachstum und -hormonsynthese. Stimulationsversuche mit 10 mU/ml TSH und 10 nmol/ml des cAMP-Agonisten Forskolin konnten diese Hypothese in den verschiedenen Zellmodellen bestätigen. Sowohl die relativen mRNA-Konzentrationen als auch die relativen Proteinkonzentrationen von SREBP-1c und SREBP-2 wurden gesteigert. Inkubationsversuche mit Cholesterol und 25-Hydroxycholesterol (25-HC) reduzierten dagegen die Proteinkonzentrationen der aktiven Formen der SREBPs. Infolge der Inaktivierung der SREBPs konnten durch die Behandlung mit 25-HC auch verminderte mRNA- und Proteinkonzentrationen des NIS und teils reduzierte mRNA-Konzentrationen der TPO beobachtet werden. Man kann daraus schließen, dass es sich bei NIS und TPO um mögliche neue SREBP-Zielgene handeln könnte. Darüber hinaus konnten in einem Inkubationsversuch an FRTL-5-Zellen mit 100 µM des PPAR alpha-Agonisten WY 14,643 deutlich erhöhte relative mRNA-Konzentrationen und Proteinkonzentrationen des SREBP-1c und des NIS beobachtet werden. Auch die relative Proteinkonzentration der aktiven Form des SREBP-2 wurde so gesteigert. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die Aktivierung des PPAR alpha die Transkription und Aktivierung der SREBPs in der Schilddrüse bewirken könnte, in deren Folge die Expression von Genen der Schilddrüsenhormonsynthese induziert wird. Für die TPO konnten diese Effekte nicht beobachtet werden. Insgesamt kann man aus den Ergebnissen dieser Arbeit ableiten, dass die SREBPs eine wichtige Rolle in der Synthese von Schilddrüsenhormonen spielen dürften. Dies stellt einen völlig neuen Aspekt in der Regulation der Schilddrüsenhormonsynthese dar. The aim of the work presented here, was the investigation of new molecular regulatory pathways in thyroid hormone synthesis under participation of the SREBPs (sterol regulatory element-binding proteins). To date it is well established that these transcription factors induce the expression of genes encoding for proteins that are responsible for synthesis of cholesterol and lipids. They are synthesized as inactive precursors and activated according to intracellular cholesterol content. Now, the expression of SREBP-1c and -2 on the transcriptional and protein level, their activation and function in the thyroid gland should be investigated for the first time. The genes of NIS (sodium-iodide-symporter) and TPO (thyroperoxidase), which play an important role in thyroid hormone synthesis, should be identified as possible SREBP target genes, additionally. Furthermore the influence of an activation of PPAR alpha (peroxisome proliferator-activated receptor alpha) on the expression of SREBPs and thyroid hormone synthesis should be investigated.Studies were performed using FRTL-5-cells and primary porcine thyrocytes. Besides the analysis of relative mRNA levels of SREBP-1c and -2, their target genes and NIS and TPO, relative protein levels of SREBPs and NIS were investigated by Western Blot, too.It was tested if SREBP gene expression was stimulated by TSH through activation of the cAMP cascade. TSH is the main stimulus for growth and hormone synthesis in the thyroid gland. Within stimulating the cells with 10 mU/ml of TSH and 10 nmol/ml of the cAMP agonist forskolin, this hypothesis could be corroborated. Besides the increased relative mRNA levels, increased relative protein levels of SREBP-1c and SREBP-2 were observed, too. Treatment of the cells with cholesterol and 25-hydroxycholesterol (25-HC) led to decreased protein levels of the mature SREBPs, as it was expected. Through this inactivation of SREBPs, treatment with 25-HC led to decreased mRNA and protein concentrations of NIS and partially reduced mRNA concentration of TPO. Thus, it can be concluded that NIS and TPO might be new target genes of the SREBPs. Above this, treatment of FRTL-5 cells with 100 µM of WY 14,643, a well-known PPAR alpha agonist, led to distinct increases in mRNA concentrations and protein levels of SREBP-1c and NIS. The protein concentration of the mature SREBP-2 was affected as well. Furthermore the relative mRNA concentration and protein level of NIS was raised by WY14,643, actually. These findings indicate that activation of PPAR alpha might induce transcription and activation of SREBPs, which results in an expression of genes involved in thyroid hormone synthesis. However, the expression of TPO was not affected. All in all one can deduce from the results of this work that SREBPs might play an important role in thyroid hormone synthesis. This is a completely new aspect in the regulation of the thyroid hormone synthesis.