Metabolitentransport im indeterminierten Leguminosenknöllchen : Untersuchungen zu Struktur und Funktion der Transportwege im Knöllchen von Vicia faba L.

Abstract

In Symbiose mit Rhizobium-Bakterien sind Leguminosen in der Lage, N2 zu fixieren. Dazu bilden sie Wurzelknöllchen, in derenZentralgewebe sich infizierte und nicht infizierte Zellen befinden. Dieses Gewebe ist umschlossen von äußerem und innerem Cortex, indem die Leitbündel eingebettet sind. Zwischen Leitbündel und infizierter Zelle liegen somit mehrere Zellschichten, die von importierten undexportierten Metaboliten überwunden werden müssen. Es ist weitgehend unbekannt, ob dieser Transport auf symplastischem oderapoplastischem Weg stattfindet. Transportprozesse könnten jedoch limitierend für die N2-Fixierung sein. Außerdem bestimmt die Art derTransportwege, ob ein unselektiver Import regulatorisch wirksamer Stoffe möglich ist. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Barrieren undWege des Metabolitentransports in indeterminierten, amidexportierenden Knöllchen von Vicia faba aufzuklären. Morphologische Voraussetzungen des Metabolitentransports wurden licht-, fluoreszenz- und elektronenmikroskopisch untersucht. Im Cortexdes Knöllchens wurden zwei endodermale Barrieren identifiziert, eine dem inneren Cortex aufgelagerte Knöllchenendodermis, sowie einevasculäre Endodermis. Cryo-Serienschnitte zeigten, dass beide Schichten bereits in submeristematischem Gewebe modifiziert sind, sichjedoch unterschiedlich entwickeln. Durch einen sehr früh angelegten Casparystreifen unterbindet die Leitbündelendodermis apoplastischeStoffflüsse. Elektronenmikroskopische Bestimmung der Plasmodesmenhäufigkeiten zeigte eine symplastische Kontinuität von vasculärerEndodermis über inneren Cortex und nicht-infizierte Zellen zu infizierten Zellen, die ihrerseits jedoch nicht untereinander verbunden waren.Regulatorisch wirksame Substanzen können daher unselektiv aus dem Leitbündel ins Zentralgewebe gelangen, was dieFeedback-Hypothese der Regulation der N2-Fixierung unterstützt. Apoplastische Transportschritte im Zentralgewebe des Knöllchens erfordern die Aktivität von Transportern in der Plasmamembran. Diesekann mit Protoplasten untersucht werden. Da herkömmliche Methoden zur Isolation von Protoplasten aus dem Zentralgewebe desKnöllchens zu defektem Material führten, wurde eine neues Protokoll zur Isolation und Separation infizierter und nicht-infizierter Zellenentwickelt. Transportstudien mit 14C-markierten Metaboliten zeigten, dass nicht-infizierte Zellen in der Lage waren, Zucker (Glucose,Saccharose) und Aminosäuren (Leucin) aufzunehmen, während infizierte Zellen dies nicht taten. Für C- und Energieversorgung sindinfizierte Zellen abhängig von nicht-infizierten Zellen, da sie keine Zucker aus dem Apoplasten aufnehmen. Ein apoplastischer Schritt desAminosäurenexports wurde durch Effluxstudien mit Gewebe untermauert. In symbiosis with rhizobial bacteria, legumes are able to fix N2. For that purpose, they develop root nodules, which contain infected anduninfected cells in their central tissue. This tissue is enclosed by an outer and inner cortex, in which the vascular system is embedded.There are several cell layers between vascular system and infected cells, which have to be crossed by imported and exported metabolites.It is largely unknown, whether this transport happens symplastically or apoplastically. However, transport processes may be limiting for N2fixation. Further, the nature of metabolite pathways will determine whether a non-selective import of regulatory compounds is possible. Theaim of this work was to elucidate putative barriers and pathways for metabolites in indeterminate, amide-exporting nodules of Vicia faba. Morphological prerequisites for metabolite movement were examined by light, fluorescence and electron microscopy. Two endodermalbarriers were identified in the nodule cortex, a nodule endodermis located above the inner cortex and a vascular endodermis. Serialcryosections revealed that both layers develop differently and are modified already in submeristematic areas. By developing a Casparianband at early stages, the vascular endodermis prevents apoplastic solute fluxes. Electron microscopical determination of plasmodesmatalfrequencies showed the presence of a symplastic continuity from vascular endodermis via inner cortex and uninfected cells to infected cells,which were not connected to each other. This symplastic continuity allows non-selective entry of regulatory substances into the centraltissue, which is in support of the feedback hypothesis of regulation of N2 fixation. Apoplastic transport steps in the central tissue of the nodule require activity of plasma membrane transporters. This can be assayed withisolated protoplasts. Since conventional methods for isolation of protoplasts from central tissue led to defect material, a new protocol forisolation and separation of infected and uninfected cells was developed. Transport studies using 14C-labelled metabolites indicated, thatuninfected cells were able to take up sugars (glucose, sucrose) and amino acids (leucine), while infected cells did not do so. Since infectedcells are not able to take up sugars from the apoplast, they are dependent on uninfected cells for supply with C and energy. The existence ofan apoplastic step for amino acid export was supported by efflux studies with isolated central tissue.