Knock-out of Flotillins in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 Genome Editing System: Effects on mRNA Splicing

Abstract

The CRISPR-Cas9 system has emerged as a versatile tool for genome editing. Using this novel technique, specific DNA modification can be achieved by designing a simple gRNA sequence complementary to the target site guiding the nuclease Cas9 towards it. The introduced double strand break is expected to be repaired by the error-prone nonhomologous end joining repair, causing a frameshift leading to a premature stop codon and subsequently a highly truncated protein. In this study, the novel CRISPR-Cas9 approach was used to generate flotillin-1, flotillin-2 and double knock-out cell lines.The screening of the single cell clones was performed by Western blot and could detect several cell clones with absence of flotillin-1, flotillin-2 or both flotillin proteins. These cell clones were characterised in the following experiments. The real-time PCR showed a persistent presence of the flotillin mRNA, but a fundamental reduction in some cell clones, indicating degradation through NMD. EGF stimulation of knock-out cell lines did not show significantly different results compared to HeLa wild-type, which can be interpreted as a consequence of adaptation to flotillin depleted conditions. The double-KO cell lines could be shown to react more sensitive to apoptosis induction upon staurosporin, but more precise results might be obtained in a time series study.Sequence analysis of the genomic DNA and cDNA derived from mRNA showed the expected indel mutations on genomic DNA, but in addition to these mutations, several different mRNA variants were detected with apparently random missing exons. In silico translation of most mRNA variants resulted in a premature stop codon, but in two mRNA variants, a frameshift caused by a non-multiple of three indel mutation was corrected by excision of a subsequent exon containing the appropriate nucleotide number. The existence of the predicted protein was proven by Western blot after inhibition of protein degradation, upon which a band corresponding to the calculated molecular weight of the truncated protein was observed. Since this mutated protein could be detected only upon degradation inhibition, it is likely to be dysfunctional and unstable, but the functional consequences of such proteins cannot be predicted. In most studies using CRISPR-Cas9 for gene knock-out, the success is monitored only by sequencing of the genomic DNA. Regarding the results of this study, it is strongly recommended to verify the results also on mRNA and protein level.

In den letzten Jahren hat sich CRISPR-Cas9 zu einer vielseitig genutzten Methode in der Gentechnik entwickelt. Mit diesem Ansatz kann eine spezifische DNA-Modifikation erreicht werden, indem man eine einfache, zur Zielstelle komplementäre gRNA-Sequenz designt, welche die Nuklease Cas9 zur vorgesehenen Schnittstelle führt. Der so eingeführte Doppelstrangbruch wird nun durch die fehlerhafte non-homologous end joining Reparatur wieder zusammengefügt, was jedoch eine Leserasterverschiebung verursacht und zu einem vorzeitigen Stopcodon und damit zu einem stark verkürzten Protein führt. In dieser Arbeit wurde der neue CRISPR-Cas9-Ansatz verwendet, um Flotillin-1-, Flotillin-2- und Doppel-Knockout Zelllinien herzustellen.Im Western Blot Screening der Einzelzellklone wurden mehrere Zellklone ohne Flotillin-1, Flotillin-2 oder ohne beide Flotillin-Proteinbanden nachgewiesen. Diese Zellklone wurden im Folgenden weiter charakterisiert. In der Real-time-PCR wurde weiterhin Flotillin-mRNA nachgewiesen, in einigen Zellklonen war diese jedoch stark verringert. Nach EGF-Stimulation konnte keine signifikant veränderte Signalantwort in Knockout-Zelllinien im Vergleich zum HeLa-Wildtyp beobachtet werden.Die Sequenzierung genomischer DNA und aus mRNA hergestellter cDNA zeigte die erwarteten Indel-Mutationen auf genomischer DNA. Zusätzlich zu diesen Mutationen wurden jedoch mehrere unterschiedliche mRNA-Varianten mit scheinbar zufällig fehlenden Exons nachgewiesen. In silico Translation der meisten dieser mRNA-Varianten führte zu einem vorzeitigen Stopcodon. In zwei mRNA-Varianten jedoch wurde die durch die Indel Mutationen verursachte Leserasterverschiebung durch das Ausschneiden eines nachfolgenden Exons mit der passenden Anzahl von Nukleotiden korrigiert. Dieses verkürzte Protein konnte nach Inhibierung des Proteinabbaus per Western Blot in vivo nachgewiesen werden, indem eine Bande detektiert wurde, die im Molekulargewicht mit der Berechnung für das verkürzte Protein übereinstimmte. Da dieses mutierte Protein nur nach Hemmung des Proteinabbaus nachgewiesen werden konnte, ist anzunehmen, dass es dysfunktional und instabil ist; dennoch können die funktionellen Konsequenzen solcher verkürzten Proteine nicht vorhergesagt werden. In vielen Anwendungsbereichen von CRISPR-Cas9 wird der Erfolg lediglich anhand von Sequenzierung genomischer DNA überprüft. Mit Blick auf die in dieser Arbeit erzielten Erkenntnisse sollte jedoch dringend empfohlen werden, Ergebnisse zusätzlich auf mRNA- und Proteinebene zu überprüfen.