Strukturelle Charakterisierung hämolymphproteingebundener N-Glykane und immunhistochemische Lokalisierung antigener Strukturen von Biomphalaria glabrata, die mit Glykokonjugaten des Humanparasiten Schistosoma mansoni kreuzreagieren

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden N-Glykane der Zwischenwirtsschnecke Biomphala¬ria glabrata, die mit Glykokonjugaten des Humanparasiten Schistosoma mansoni serolo¬gisch kreuzreagieren, strukturell charakterisiert. Dazu waren die N-Glykane aus Hämolymphproteinen nicht-infizierter Schnecken nach proteolytischem Verdau enzyma¬tisch freigesetzt, durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von immobilisierten Antikörpern gegen lösliche Eiantigene von S. mansoni (anti-SEA) angereichert, entsprechend ihrem Bindevermögen an das fucosespezifische Aleuria aurantia Lektin subfraktioniert und mit HPLC aufgetrennt worden. Insgesamt wurden über 100 verschie¬dene N-Glykane detektiert. Die strukturelle Charakterisierung durch MALDI-TOF-MS(/MS) und ESI-IT-MS(/MS) ergab, dass mit (beta1-2)-kerngebundener Xylose und Fuc(alpha1-3)GalNAc(beta1-4)GlcNAc (F-LDN)-Resten mindestens zwei serologisch kreuzreagie¬rende Kohlenhydratepitope auf den N-Glykanen vorliegen. Die jeweiligen Glykane wiesen eine allgemeine Monosaccharidzusammensetzung von MeH0-2H2-6N2-8X0-1F0-3-PA auf. Der Nachweis von 2-substituierten Fucose-Resten im Gesamtgemisch ist als Indiz für das Vorkommen von GalNAc(beta1-4)[Fuc(alpha1-2)Fuc(alpha1-3)]GlcNAc (LDN-DF) als weiterem kreuzreagierendem Epitop zu werten. Darüber hinaus wurden zum Teil 3-O-Methylmannose-Reste nachgewiesen, die jedoch nicht zur Kreuzreaktivität beitragen. Immunhistochemische Untersuchungen bestätigten die Präsenz von kreuzrea¬gierenden Kohlenhydrat-Determinanten im Fuß- und Mitteldarmdrüsengewebe un¬infizierter B. glabrata. Während die Epitope GalNAc(beta1-4)GlcNAc (LDN), Gal¬NAc(beta1-4)[Fuc(alpha1-3)GlcNAc (LDN-F) und LDN-DF im Mitteldarmdrüsengewebe von uninfizier¬ten B. glabrata serologisch kaum nachweisbar waren, wurden sie in infizierten Schnecken besonders im Bereich der Sporozysten detektiert, wo auch polyklonale Antikörper gegen Eiantigene von S. mansoni (anti-SEA) und monoklonale Antikörper gegen das F-LDN Epitop eine starke Bindung zeigten. Parallel durchgeführte Untersuchun¬gen von Hämolymphproben des empfänglichen B. glabrata Puerto Rico (PR) Stammes und des resistenteren Salvador (SAL) Stammes zeigten, dass zwar bei bei den Stämmen die gleichen kreuzreagierenden N-Glykane vorkommen, dass deren Expression im PR-Stamm jedoch mengenmäßig deutlich stärker ausgeprägt ist. Zusammengefasst trug diese Studie dazu bei, neue N-Glykanstrukturen von B. glabrata strukturell zu charakterisieren. Die erhobenen Befunde stehen in Einklang mit der Hypothese, dass molekulare Mimikry auf der Basis von Kohlenhydratstrukturen dazu beitragen könnte, Parasiten die Invasion und das Überleben im Wirt zu ermöglichen.

In the present study N-glycans of the freshwater snail Biomphalaria glabrata, which share a serological cross-reactivity with glycoconjugates derived from human parasitic trematode Schistosoma mansoni, were structurally characterised. To this end, N-glycans were enzymatically released by PNGase F treatment from tryptic haemolymph (glyco-) peptides of non-infected B. glabrata and fluorescently labelled with 2-aminopyridine. This fraction had been enriched by immunoaffinity chromatography using immobilised antibodies raised against soluble egg antigens (anti-SEA) derived from S. mansoni, further subfractionated due to their binding affinity to the fucose-specific lectin from Aleuria aurantia and subsequently separated by size-fractionation HPLC. Taken together, more than 100 different compositional types of N-glycan were detected. Structural characterisation by MALDI-TOF-MS(/MS) and ESI-IT-MS(/MS) resolved in (beta1-2)-core-bound xylose and Fuc(alpha1-3)GalNAc(beta1-4)GlcNAc (F-LDN) as at least two serologically cross-reacting carbohydrate moieties present on the N-glycans. The glycans obtained exhibited a general monosaccharide composition of MeH0-2H2-6N2-8X0-1F0-3¬-PA. The detection of 2-substituted fucose in the total glycan pool underlined the presence of GalNAc(beta1-4)[Fuc(alpha1-2)Fuc(alpha1-3)]GlcNAc- (LDN-DF) as a further cross-reacting carbohydrate epitope. Furthermore, 3-O-methylated mannose residues have been identified, but have been found not to contribute to the serological cross-reactivity. Immunohistochemical staining confirmed the presence of cross-reacting carbohydrate motifs in the foot and mid-gut gland tissues of uninfected B. glabrata. The epitopes GalNAc(beta1-4)GlcNAc- (LDN), GalNAc(beta1-4)[Fuc(alpha1-3)]GlcNAc- (LDN-F) and LDN-DF were only weakly detectable in the mid-gut gland tissue of uninfected B. glabrata. In the same tissue of infected B. glabrata, however, these epitopes were strongly expressed, especially in the area of the sporocysts, whilst polyclonal antibodies raised against the soluble egg antigens of S. mansoni and monoclonal antibodies specific for the F-LDN motif also showed strong binding to infected tissue. In parallel, investigation of the cross-reacting N-glycans from the susceptible B. glabrata Puerto Rico (PR) strain in comparison with the more resistant Salvador (SAL) strain showed that the same cross-reacting glycans occur in both strains, but that their amount is increased in the PR strain. In summary, this study has contributed to a structural characterisation of novel N-glycans from B. glabrata. The results are in accordance with the hypothesis of molecular mimicry , in that, host-type carbohydrate structures expressed by the parasite may facilitate its invasion and survival within the host.