Role of Notch signaling in pulmonary hypertension

Abstract

Pulmonary Hypertension is a disease condition characterized by elevated pulmonary vascular resistance which is an outcome of excessive vascular remodeling in pulmonary arteries involving deregulated proliferation of cells in all three layers of the vessels; intima, media as well as adventitia. New therapeutic options targeting vascular remodeling process are being developed and some are curently under clinical trials. Current evidence strongly supports involvement of Notch signaling in vascular homeostasis and injury. Recently, the impact of Notch3 and its target gene, Hes5 on increased proliferation of PASMCs in PAH patients has been described. However, the role of other Notch receptors and ligands has not been studied. This led us to investigate the expression and potential contribution of Notch signaling pathway in pathogenesis of PH. Interestingly, we observed an increased expression of Notch1 in lungs and pulmonary arteries from patients with IPAH. In line with this finding, increased Notch1 immunoreactivity was detected in intima of pulmonary arteries in lung tissues from IPAH patients as compared to donors. Furthermore, similar upregulation was observed in lungs from Hypoxia+Su5416 rats as compared to healthy rats. We demonstrate for the first time an upregulation of Notch1 in pulmonary hypertension patients. Additionally, absence of this increase in other two well established experimental models depicting only medial hypertrophy phenotype, monocrotaline rat model and chronic hypoxia mice model, led us to hypothesize that Notch1 may contribute substantially to pathogenesis of plexiform lesions.In vasculature, Notch1 expression is observed in both smooth muscle cells and endothelial cells. We demonstrated a decrease in proliferation and increase in apoptosis of human pulmonary artery endothelial cells (hPAECs) with siRNA mediated Notch1 inhibition. In contrast, an increase in proliferation and survival of hPAECs was observed on constitutive Notch1 activation. These effects were associated with modulation of expression of cell cycle inhibitor, p21 and apoptosis inhibitor, Bcl-2. Interestingly, Notch1 inhibition or activation did not have any effect on proliferation of human pulmonary artery smooth muscle cells (hPASMCs), indicating, endothelial cell specific effect of Notch1 signaling in vasculature. The anti-proliferative and pro-apoptotic effect of Notch1 signaling inhibition, observed in our results, puts forward Notch inhibition as a therapeutic option for treatment of pulmonary hypertension. Presently, gamma secretase inhibitors (GSIs) are the only clinically available inhibitors targeting this pathway. GSIs inhibit the γ secretase enzyme, responsible for cleavage of Notch receptors. In order to examine the relevance of GSIs as a therapy in experimental PH, we used DBZ (a commercially available GSI) for our in vitro studies. Inhibition of Notch signaling by employing DBZ effectively reduced expression of Hes-1 (target gene of Notch signaling pathway) and attenuated proliferation of both, hPAECs and hPASMCs. Taken together, this study puts forward a role of Notch1 signaling in regulation of proliferation and apoptosis of endothelial cells which might contribute to formation of plexiform lesions observed in pulmonary hypertension. Nonetheless, our study needs to be further substantiated with in vivo studies using GSI in Hox+Su5416 rat model of PH. Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine Erkrankung der Lungengefäße, die durch einen erhöhten pulmonalen Gefäßwiderstand charakterisiert ist. Strukturelle Umbauprozesse in den pulmonalen Gefäßen finden in allen drei Gefäßschichten Intima, Media und Adventitia- statt ist und sind durch dysregulierte Proliferation/Apoptose von verschiedenen Gefäß-Zellen ausgezeichnet. Neue therapeutische Optionen, die den Prozess des Gefäßumbaus aufhalten oder umzukehren, befinden sich momentan in der Entwicklung oder in klinischen Studien. Der derzeitige Stand der wissenschaftlichen Erkenntnis legt eine Involvierung von Notch-Signalübertragungs¬wegen in die vaskulare Homöostase nahe. So konnte unlängst der Einfluss von Notch3 und dessen Zielgen Hes5 auf die erhöhte Proliferation von pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMCs) in Patienten mit pulmonalarterieller Hypertonie (PAH) nachgewiesen werden. Der jeweilige Einfluss anderer Notch-Rezeptoren sowie deren Liganden wurde jedoch noch nicht beschrieben. In Folge dessen untersuchten wir die Expression und den potenziellen Beitrag von Notch-Signalwegen in der Pathogenese von PH.Interessanterweise konnten wir eine erhöhte Expression von Notch1, sowohl in Lungen, als auch in Pulmonalarterien von IPAH-Patienten beobachten. In Übereinstimmung mit dieser Erkenntnis wurde eine erhöhte Notch1-Immunreaktivität in der Intima von Pulmonalarterien in Lungengewebe von IPAH-Patienten verglichen mit Donoren detektiert. Des Weiteren wurde eine ähnlich erhöhte Expression in Lungen von Ratten mit PH (Hypoxia+Su5416 Modell) verglichen mit gesunden Ratten beobachtet. Damit demonstrieren wir zum ersten Mal eine Hochregulation von Notch1 in Patienten mit pulmonaler Hypertonie. Zusätzlich lässt die Abwesenheit dieser Hochregulation in zwei weiteren gut etablierten experimentellen Modellen mit medialer Hypertrophie, dem Monocrotalin-injizierten Ratten-Model und dem Maus-Modell mit chronischer Hypoxie, die Hypothese zu, dass Notch1 substanziell zu der Pathogenese von plexiformen Läsionen beiträgt. Im Gefäßsystem selbst wird Notch1-Expression sowohl in der glatten Muskulatur als auch in den Endothelzellen beobachtet. Wir konnten eine erniedrigte Proliferation und eine erhöhte Apoptoserate in humanen pulmonal-arteriellen Endothelzellen (hPAECs) nach erfolgter siRNA-vermittelter Inhibition von Notch1 demonstrieren. Im Gegensatz dazu konnte eine erhöhte Proliferation und Überlebensrate von hPAECs nach konstitutiver Notch1-Aktivierung beobachtet werden. Diese Effekte waren mit modulierter Expression des Zellzyklus-Inhibitors p21 und des Apoptose-Inhibitors Bcl-2 assoziiert. Interessanterweise zeigten weder Notch1-Inhibition noch Aktivierung einen Effekt auf die Proliferation von humanen pulmonal-arteriellen glatten Muskelzellen (hPASMCs), was einen Endothel-spezifischen Effekt von Notch1-Signalwegen im Gefäßsystem indiziert. Die beobachteten anti-proliferativen und pro-apoptotischen Effekte nach Inhibition von Notch1-Signalwegen kennzeichnen die Notch1-Inhibition als therapeutische Option für pulmonale Hypertonie. Derzeitig sind gamma-Sekretase-Inhibitoren (GSIs) die einzigen klinisch verfügbaren Inhibitoren für diesen Signalweg. GSIs inhibieren das Enzym y-Sekretase, das verantwortlich für die Spaltung von Notch-Rezeptoren ist. Um die Relevanz von GSIs als Therapie für experimentelle pulmonale Hypertonie zu untersuchen, haben wir den kommerziell verfügbaren GSI DBZ in unseren in vitro Studien appliziert. Inhibition des Notch-Signalwegs durch die Anwendung von DBZ reduzierte effektiv die Expression von Hes1, das Zielgen des Notch-Signalwegs, und schwächte die Proliferation von sowohl hPAECs als auch von hPASMCs ab. Zusammengefasst zeigt diese Studie die Rolle von Notch1-Signalwegen in Proliferation und Apoptose von Endothelzellen, die zur Entstehung von plexiformen Läsionen, wie sie bei der pulmonalen Hypertonie beobachtet werden, beitragen können. Gleichwohl muss unsere Studie weiter durch in vivo Studien mit Applikation von GSI in experimentellen Modellen der PH untermauert werden.