Molekulare Charakterisierung der Interaktion zwischen dem zellulären Rezeptor CD46 und dem viralen Liganden von BVDV

Abstract

Ausgehend von der Arbeitshypothese, dass es sich beim bovinen CD46 um einen möglichen zellulären Rezeptor für das Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) handelt, wurden die molekularen Interaktionen zwischen diesem Molekül und dem Virus näher untersucht und folgende Ergebnisse erzielt: 1. Durch Etablierung eines sensitiven Bindungstests konnte die Adsorption von [3H]-Uridin markiertem BVDV an CD46bov exprimierende Zellen eindeutig nachgewiesen werden. Zusammen mit einer CD46 bedingten Steigerung der Empfänglichkeit von porzinen Zellen (SK6-Zellen) sind die Kriterien erfüllt, um CD46bov als zellulären Rezeptor für BVDV zu bezeichnen. 2. Die Bindungsstelle von BVDV im modular aus 4 CCP-Domänen aufgebauten CD46 Molekül wurde durch 4 Deletions-, 2 Insertions- und 17 Austauschmutationen lokalisiert. Ein auf 3 CCP-Domänen verkürztes CD46 besitzt keine Rezeptorfunktion mehr. Durch homologe Austausche der CCP Module mit porzinem CD46 konnte CCP1 eindeutig als essentiell für die BVDV Bindung und Infektion identifiziert werden. Die Feinkartierung der Bindungsstelle ergab eine wichtige Funktion der sechs in der C-terminalen Hälfte von CCP1 lokalisierten Aminosäuren G40QVLAL45. Die Insertion von zusätzlichen CCPDomänen in CD46 lieferte Hinweise für die mögliche Beteiligung von CCP2 an derBVDV Bindung und Infektion. 3. Mit Hilfe eines Zelladsorptionstests konnte das Glykoprotein E2 von BVDV NADL als CD46bov-bindender Ligand identifiziert werden. Weder das E2 Glykoprotein vom Virus der klassischen Schweinepest (KSPV) noch Erns von BVDV zeigten eine Bindung. Durch Austausch homologer Bereiche im E2 von BVDV und KSPV gelang die Einengung des CD46bov bindenden Bereichs auf die Aminosäuren 57-293. Hierfür wurden 14 E2-Chimären etabliert. Die weitere Untersuchung chimärer E2 Moleküle mit Hilfe reverser Genetik ergab, dass die Anwesenheit der Aminosäuren 57-293 des BVDVE2 im KSPV E2 zu einem Wirtswechsel führte, denn bovine Zellen waren deutlich besser zu infizieren

The working hypothesis that bovine CD46 acts as a possible cellular receptor for bovine viral diarrhoea virus (BVDV) was the basis for the examination of the interactions between this molecule and the virus. The following results were obtained: 1. Specific binding of [3H]-uridine labeled BVDV to CD46bov expressing cells was unambigously shown. This together with the CD46 mediated increase of the susceptibility of porcine cells (SK6 cells) towards BVDV strongly suggests that CD46bov acts as a cellular receptor for BVDV. 2. The BVDV binding domain in the CD46 molecule which consists of 4 modular CCPDomains was identified by construction of 4 deletions, 2 insertions and 17 exchange mutations. The truncated CD46 molecule containing only 3 CCP modules displayed no receptor function. Homologous exchanges of the CCP modules with those of porcine CD46 revealed that bovine CCP1 is essential for BVDV binding and infection. 6 amino acids (G40QVLAL45) in the C-terminal half of CCP1 were mapped as an importantbinding domain. The insertion of additional CCP-Domains into the CD46 molecule suggests that CCP2 is involved in BVDV binding and infection. 3. Using a cell adsorption assay the BVDV NADL glycoprotein E2 could be identified as CD46bov-binding ligand. Neither for classical swine fever virus (CSFV) E2 nor BVDV Erns binding to CD46bov was detected. By exchanging homologous domains in E2 of BVDV and CSFV and by establishing 14E2-chimeras a binding domain between amino acid 57-293 could be mapped. Further investigations of glycoprotein E2-chimeras using reverse genetics revealed that the insertion of amino acids 57-293 of BVDV E2 into CSFV E2 led to a change in host range. The modified CSFV infected bovine cells more efficiently than porcine cells.