Charakterisierung einer konservierten Region in der Internen Ribosomen-Eintrittsstelle der RNA des Maul- und Klauenseuche-Virus

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde ein innerhalb der Gruppe der Cardio- und Aphthoviren hochkonserviertes Sequenzelement in der viralen internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) im Bezug auf die Bindung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors eIF4G und der Translationsaktivität des FMDV- (engl. für: foot-and-mouth-disease virus) IRES-Elements untersucht. Das FMD-Virus mit seinen sieben Serotypen ist der einzige Vertreter der Gruppe der Aphthoviren und gehört zur Familie der Picornaviridae. Im Gegensatz zur Translation zellulärer eukaryotischer mRNAs findet die Initiation der Translation bei diesen Virus-RNAs nicht Cap-abhängig am 5 -Ende der RNA statt, sondern erfolgt intern an einer hoch strukturierten Region im 5 -nichttranslatierten Bereich der viralen RNA. Aufgrund der Struktur ihrer IRES-Elemente werden die Picornaviridae in drei Gruppen untergliedert, wobei die FMDV-IRES zu den Typ II Elementen zählt. Das IRES-Element besteht aus fünf unterschiedlich strukturierten Haarnadelstrukturen, den sogenannten Stem-Loops, denen sich ein Polypyrimidin-Trakt und zwei Translationsstartcodons anschließen. Das hier untersuchte konservierte Sequenzelement befindet sich im Stem-Loop 4, der auch die Hauptbindungsdomäne für die zellulären Initiationsfaktoren eIF4G und eIF4B ist. eIF4G kommt im Initiationskomplex eIF4F zusammen mit den Faktoren eIF4E und eIF4A vor und wird als multifunktionales Adapterprotein angesehen, da es während der Translationsinitiation noch mit weiteren Proteinen interagiert. eIF4G vermittelt den Kontakt der ribosomalen 40S-Untereinheit mit der zellulären beziehungsweise picornaviralen mRNA, was voraussetzt, dass eIF4G selbst an die mRNA binden muss. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das untersuchte Sequenzelement essentiell für die Bindung von eIF4G ist. Mit verschiedenen Mutationen, die sowohl nur die Primärsequenz als auch die Sekundärstruktur verändern, konnten unterschiedliche Bindungsaffinitäten von eIF4G zu den jeweiligen Mutanten-IRES-RNAs und damit übereinstimmend auch unterschiedliche Translationsaktivitäten der jeweiligen IRES-Elemente festgestellt werden. So zeigten die Mutationen in einem Bereich mit vier gepaarten Nukleotiden, dass sowohl die Primärsequenz als auch die Sekundärstruktur wichtig sind. Mutationen in zwei ungepaarten Dinukleotid-Bereichen ergaben, dass hier die Sekundärstruktur wichtiger als die Primärsequenz ist. Verschiedene Mutationen in einem weiteren Bereich mit zwei gepaarten Dinukleotiden führten zu dem Schluss, dass dieser Bereich nur indirekt an einer Bindung von eIF4G beteiligt ist, sondern eher zur Aufrechterhaltung der sterischen Bedingungen in dieser konservierten Region beiträgt. Der Versuch, das Translationsdefizit durch Erhöhung der eingesetzten RNA-Mengen zu kompensieren, führte zu der Beobachtung, dass dadurch die Wahl des Translationsstarts beeinflusst wird. Die Bindungs- und Translationsstudien wurden bei verschiedenen Kaliumchlorid-Konzentrationen durchgeführt und zeigen, dass die Bindung von eIF4G an die Mutanten-IRES-RNAs auch von der Salzkonzentration beeinflusst wird. Darüber hinaus wurde ebenfalls ein cis-Effekt des FMDV-IRES-Elements im dicistronischen Kontext auf das 5´-gelegene Reportergen beobachtet.