Zellzyklusinhibition zur Therapie der pulmonalen arteriellen Hypertonie

Abstract

Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine fortschreitende Erkrankung des pulmonalen Gefäßsystems mit ungünstiger Prognose und eingeschränkten Therapiemöglichkeiten. Im Mittelpunkt steht u.a. ein struktureller Umbau der Gefäßwand, der zur Verengung des Lumens der distalen arteriellen Gefäße und letztendlich zum Rechtsherzversagen führt. Einen wichtigen Pathomechanismus stellt das übermäßige Wachstum der glatten Muskelzellen der Pulmonalarterien (PASMCs) dar. Während Dysregulierungen des Zellzykluses in Tumoren eine wichtige Rolle spielen und sich als Therapieansatz etabliert haben, wurden Parallelen im Proliferationsverhalten von Tumorzellen zu PASMCs bei PAH beschrieben. Auch für PASMCs ließen sich je nach Wachstumsverhalten pathologische Expressionsmuster der Zellzyklus-relevanten Proteine nachweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits humane Lungenhomogenisate auf ihre aberrante Zellzyklusexpressionen hin untersucht und andererseits die pharmazeutischen Zellzyklusinhibitoren, Dinaciclib und Palbociclib, die bereits in Tumorzelllinien erfolgreich eingesetzt wurden, an PASMCs getestet. Die zugrunde liegende Hypothese ist, dass dadurch die Proliferation der PASMCs unterbunden und somit der pathologische Umbau der Gefäßwand reduziert werden soll. Während sich in den Proteinanalysen der humanen Lungenhomogenisaten aufgrund hoher interindividueller Heterogenität kein eindeutiger Unterschied zeigen ließ, konnte die gezielte Inhibition der Zyklin-abhängigen-Kinasen (CDKs) zu einem Arrest des Zellzykluses und damit zur signifikanten Abnahme der exzessiven Proliferation führen. Dabei zeigten Proliferations-Studien eine Abnahme der Proliferation mit linearer Dosis-Wirkungs-Beziehung bereits im nano- bis mikromolaren Bereich. Durchflusszytometrische Messungen, sowie Protein- und mRNA-Analysen konnten den Mechanismus des Zellzyklusarrestes über Suppression der Phosphorylierung des Retinoblastom-Proteins (RB-Protein) molekularbiologisch nachweisen. Die für antiproliferative Medikamente häufig beobachteten Nebenwirkungen, wie z.B. eine Apoptose-Induktion, konnten für beide Inhibitoren in den Proliferations-Tests, der Durchflusszytometrie und den Protein-Analysen nicht beobachtet werden. Damit konnte insgesamt ein umfassender in vitro-Datensatz erhoben werden, der einen Ausgangspunkt für weiterführende Studien bietet, mit dem Ziel der zukünftigen Nutzung von synthetischen Zellzyklusinhibitoren als neuen Ansatz zur Behandlung der PAH.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease of the pulmonary vasculature, associated with poor prognosis and limited therapy options. Crucial for the development of the disease is a structural remodeling process of the vascular wall, which leads to obstruction of the lumen and eventually to right heart failure, due to elevated vascular resistance and pressure levels. An important role within this process is the excessive proliferation of the smooth muscle cells of the pulmonary artery (PASMCs). While it became clear that a dysregulation of proteins of the cell cycle contributes to the pathogenesis and serves as a therapeutic target in many different tumor types, several authors also described parallels between tumor cells and PASMCs in PAH concerning their uncontrolled proliferation behavior. Moreover, according to the literature, proliferation of PASMCs seems also tightly connected to different expression levels of proteins that regulate the cell cycle. In this work, at first human lung homogenates were screened for aberrant expression of cell cycle proteins. Secondly, the cell cycle inhibitors Dinaciclib and Palbociclib, which have been already successfully used in tumor cell lines, were tested for their antiproliferative potential in isolated PASMCs, to reduce the proliferation of PASMCs and thereby reverse the structural remodeling process. While the screening of the human lung homogenates displayed no significant difference due to high individual heterogeneity, inhibition of cyclin-dependent-kinases (CDKs) in isolated PASMCs lead to an arrest of the cell cycle, thereby causing a significant decline in proliferation. This could be demonstrated by proliferation assays which showed a decrease in cellular growth in a linear dose dependent manner within a nano- to micromolar range. Flow cytometry analysis, as well as protein and mRNA analyses, could demonstrate the anti-proliferative mode of action of both CDK inhibitors, namely the suppression of phosphorylation of the retinoblastoma protein (RB-protein) on a molecular level. Toxic side effects could not be detected for these drugs in their used concentration, judged from the absence of apoptosis induction in the proliferation assays, flow cytometry and protein analyses. General speaking, a comprehensive in vitro data set was generated, which offers a promising starting point for future tests in vivo. Especially concerning the predominant vasodilative nature of current therapies in PAH, inhibition of excessive PASMC proliferation might lead to a reversal of the pathological remodeling process of the vascular wall thereby providing a new therapeutic option in the therapy of PAH.