Characterization of NETosis-derived effector mechanisms against Besnoitia besnoiti in cattle

Abstract

Besnoitia besnoiti is the causative agent of bovine besnoitiosis, a disease that affects both, animal welfare and cattle productivity. Neutrophil extracellular trap (NET) formation represents an important innate effector mechanism of polymorphonuclear neutrophils (PMN) acting against various pathogens. Recently, NETs release was reported in response to B. besnoiti tachyzoites. However, limited knowledge is available on the role of metabolic pathways during parasite-triggered NET formation, nowadays known as NETosis. By analysing metabolic signatures of tachyzoite-exposed PMN and applying functional inhibition experiments, we here aimed to investigate the importance of distinct PMN-derived metabolic pathways for effective B. besnoiti tachyzoite-induced NETosis. Overall, exposure to heat-inactivated tachyzoites induced an increase in glucose and serine consumption, a drop in glutamine consumption and an enhancement of glutamate and alanine production in bovine PMN. Moreover, tachyzoite-induced formation of cell free NETs was significantly diminished via PMN pretreatments with dichloroacetate (pyruvate dehydrogenase inhibitor), oxythiamine (inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinase) and oxamate (inhibitor of lactate dehydrogenase), thereby indicating a key role of pyruvate- and lactate-mediated metabolic pathways for proper tachyzoite-mediated NETosis. In line, NET formation was also induced by enhanced pH, however, blockers (AR-C141900, AR-C151858) of lactate transporters failed to influence NETosis. Moreover, a significant reduction of tachyzoite-induced NET formation was also achieved by treatments with oligomycin (inhibitor of ATP synthase) and NF449 (purinergic receptor P2X1 antagonist) which suggested a pivotal role of ATP availability in this effector mechanism. In contrast, treatments with inhibitors of early steps of glycolysis or glutaminolysis did not affect parasite-triggered NETosis. These current data will provide a better understanding of metabolic pathways involved in B. besnoiti tachyzoite-induced NETosis.Moreover, tachyzoites of B. besnoiti induced LC3B-related autophagosome formation in parallel to NETosis in bovine PMN. Notably, both rapamycin- and wortmannin-treatments failed to influence B. besnoiti-triggered NETosis and autophagosome formation. Also, isolated NETosis failed to induce autophagy suggesting independence between both cellular processes. Interestingly, enhanced phosphorylation of AMPKα, a key regulator molecule of autophagy, was observed within the first minutes of interaction in tachyzoite-exposed bovine PMN thereby emphasizing that B. besnoiti-triggered NETosis indeed occurred in parallel to autophagy.In addition, we investigated early effector mechanisms of bovine PMN being exposed to vital B. besnoiti bradyzoite stages, which were isolated from skin tissue cysts of a naturally infected animal presenting characteristic symptoms of bovine besnoitiosis. Histopathological examinations confirmed the presence of typical roundish, large-sized cysts in subdermal biopsies. After PMN:B. besnoiti bradyzoites co-cultures, scanning electron microscopy (SEM)- and epifluorescence microscopy-analyses demonstrated a fine network of NET-like structures being released by bovine PMN and efficiently ensnaring bradyzoites. Classical NETosis-associated components were confirmed in these extracellular structures via immunofluorescence analyses on extracellular DNA, histone (H1-H4) and neutrophil elastase (NE) colocalization. Besides NETosis, an increased formation of autophagosomes (visualized by specific-LC3B staining) was observed in bradyzoite-stimulated PMN. Statistical analyses revealed a significant positive correlation (p = 0.042) between the occurrence of NETosis and autophagy in these immunocompetent cells. These findings suggest NETosis plays a pivotal role in early innate host responses against bradyzoite stages and furthermore deliver first evidence on autophagy being associated with B. besnoiti bradyzoite-induced NETosis. Besnoitia besnoiti ist der Erreger der Rinderbesnoitiose, einer Erkrankung, die die Tierproduktivität beeinträchtigt und auch tierschutz-relevant ist. Die Bildung sogenannter ´neutrophile extracellular traps (NETs) stellt einen wichtigen angeborenen Effektormechanismus von Neutrophilen dar, der gegen verschiedene Pathogene wirkt. Vor kurzem wurde über die Freisetzung von NETs, die auch als NETosis bezeichnet wird, als Reaktion auf B. besnoiti-Tachyzoiten berichtet. Über die Rolle von Stoffwechselwegen bei durch Parasiten ausgelöster NETosis ist jedoch nur ein begrenztes Wissen verfügbar. In der vorliegenden Arbeit wurden Stoffwechselsignaturen von Tachyzoiten-exponierter Neutrophilen (PMN) analysiert und Experimente zur funktionellen NETosis-Hemmung durchgeführt. Weiterhin wurde die Bedeutung verschiedener PMN-abgeleiteter Stoffwechselwege für eine durch B. besnoiti-Tachyzoiten und -Bradyzoiten induzierte NETosis untersucht. Insgesamt führte die Exposition gegenüber hitzeinaktivierten Tachyzoiten zu einem Anstieg des Glukose- und Serin-Verbrauchs, einem Rückgang des Glutamin-Verbrauchs und einer Steigerung der Glutamat- und Alanin-Produktion in exponierten Rinder-PMN. Darüber hinaus wurde die Tachyzoiten-induzierte Bildung zellfreier NETs durch PMN-Vorbehandlung mit Dichloracetat (Pyruvatdehydrogenase-Inhibitor), Oxythiamin (Inhibitor der Pyruvatdehydrogenase-Kinase) und Oxamat (Inhibitor der Lactatdehydrogenase) signifikant reduziert, was auf eine Schlüsselrolle der Pyruvat- und Laktat-vermittelten Stoffwechselwege für die richtige Tachyzoit-vermittelte NETosis hinweist. In der Folge wurde die NETosis-Bildung auch durch einen erhöhten pH-Wert induziert, jedoch konnten Laktat-Transporter-Blocker (AR-C141900, AR-C151858) die NETosis nicht beeinflussen. Eine signifikante Reduktion der Tachyzoiten-induzierten NET-Bildung wurde auch durch Behandlung mit Oligomycin (Inhibitor der ATP-Synthase) und NF449 (purinergischer Rezeptor P2X1-Antagonist) erreicht, was auf eine zentrale Rolle der Verfügbarkeit von ATP hindeutet. Im Gegensatz dazu beeinflussten Behandlungen mit Inhibitoren der frühen Schritte der Glykolyse oder Glutaminolyse die durch Parasiten ausgelöste NETosis nicht. Diese genauen Daten vermitteln ein besseres Verständnis der Stoffwechselwege, die an der Bildung von durch B. besnoiti-Tachyzoiten induzierten NETosis beteiligt sind.Weiterhin induzierten Tachyzoiten von B. besnoiti die Bildung von LC3B-verwandten Autophagosomen parallel zur NETosis in Rinder-PMN. Bemerkenswerterweise beeinflusste weder eine Rapamycin- noch eine Wortmannin-Behandlung die durch B. besnoiti ausgelöste NET-Bildung und die Bildung von Autophagosomen. Auch isolierte NETs induzierten keine Autophagie, was die Unabhängigkeit zwischen beiden zellulären Prozessen nahelegt. Interessanterweise wurde innerhalb der ersten Minuten der Wechselwirkung in Tachyzoiten-exponierten Rinder-PMN eine verstärkte Phosphorylierung von AMPKα, einem der wichtigsten Regulatormoleküle der Autophagie, beobachtet. Dies unterstreicht, dass die durch B. besnoiti ausgelöste NET-Bildung tatsächlich parallel zur Autophagie auftritt.Außerdem wurden frühe Effektormechanismen von Rinder-PMN, die vitalen, aus Hautgewebszysten eines infizierten Tieres isolierten B. besnoiti-Bradyzoiten ausgesetzt waren untersucht. Histopathologische Untersuchungen bestätigten das Vorhandensein von typischen runden, großformatigen Zysten in Hautbiopsien. Nach PMN:B.besnoiti- Bradyzoiten Co-Kulturen, Rasterelektronen- und Fluoreszenzmikroskopieanalysen zeigten ein feines Netzwerk NETosis-ähnlicher Strukturen, die von PMN von Rindern und verstrickten Bradyzoiten freigesetzt wurden. Klassische NETosis-Komponenten wurden in diesen Strukturen durch Immunfluoreszenzanalysen an extrazellulärer DNA, Histone (H1-H4) und Neutrophilen-Elastase (NE)-Co-Lokalisation, bestätigt. Neben NETosis wurde in Bradyzoiten-stimulierten PMN auch eine erhöhte Bildung von Autophagosomen (sichtbar durch spezifische LC3B-Färbung) beobachtet. Statistische Analysen zeigten eine signifikante positive Korrelation (p = 0,042) zwischen dem NETosis-Auftreten und der Autophagie in diesen angeborenen Immunzellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NETosis eine zentrale Rolle bei frühen angeborenen Wirtsreaktionen gegen B. besnoiti-Bradyzoiten spielt und liefern darüber hinaus erste Beweise für die Autophagie, die mit der durch B. besnoiti-Bradyzoiten induzierten NET-Bildung assoziiert ist.