Morphologische Untersuchung AAV-transduzierter Retinae nach subretinaler Injektion in Ratten

Abstract

Ziel: Beurteilung der Effekte der subretinalen Injektion, des AAV-vermittelten Gentransfers und der GFP-Expression in Photorezeptoren auf die Morphologie der Retina und den Apoptose-Status retinaler Zellen in Ratten, denen entweder eine Fluoreszein-Lösung oder ein AAV2/5-Vektor mit dem GFP-Gen unter einem CMV-Promoter subretinal injiziert wurde.Methoden: Untersuchung der Morphologie der äußeren Körnerschicht mittels immuncytochemischer Markierung zellulärer Zielstrukturen und konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie sowie Transmissionselektronenmikroskopie; Quantifikation der Synapsen in der OPL; Beurteilung des Gliose-Status; TUNEL-Assay.Ergebnisse: Trotz der hohen Plastizität synaptischer Strukturen vor allem in der äußeren plexiformen Schicht, die auf verschiedentlich verursachte Degenerationen und Verletzungen mit typischen Reaktionsmustern, wie Verkürzung und Rückzug der Stäbchen-Endknöpfchen, Aussprossungen dendritischer Fortsätze von Horizontal- und Bipolarzellen sowie Bildung ektoper Synapsen reagieren, konnten in dieser Studie keine histologischen Veränderungen festgestellt werden. Sowohl bei Fluoreszein-injizierten als auch bei GFP-transduzierten Retinae zeigte sich die äußere plexiforme Schicht strukturell normal organisiert und es fanden sich keine Anzeichen für eine Verkürzung und einen Rückzug der Stäbchen-Terminalien. Horizontal- und Stäbchen-Bipolarzellen wiesen keinen Verlust dendritischer Endigungen auf und insbesondere zeigten sich keine Aussprossungen von Zellfortsätzen in die äußere Körnerschicht. Auch auf ultrastruktureller Ebene zeigten sich Zapfen-Füßchen und Stäbchen-Terminalien unverändert. Die Anzahl synaptischer Kontakte zwischen Stäbchen und Stäbchen-Bipolarzellen war nicht reduziert. Obwohl die durch die subretinale Injektion verursachte vorübergehende Netzhautablösung zu einer verstärkten GFAP-Expression in den Müller-Zellen führt, fanden sich keine Anzeichen für eine schwerere Gliose. In behandelten Netzhäuten tritt kein vermehrter Zelltod durch Apoptose auf.Schlussfolgerungen: Der AAV-vermittelte Gentransfer und die Expression des GFP-Transgens in den Photorezeptoren führen weder zu morphologischen Veränderungen der Netzhaut noch zu einer erhöhten Apoptoserate. Es handelt sich somit um einen sicheren und effizienten Weg zur Einbringung eines Transgens in Zellen der äußeren Retina.

Purpose: To determine the effects of vector-delivery via subretinal injection, AAV-mediated gene-transfer to photoreceptors and GFP-expression within photoreceptors on retinal morphology and apoptotic status of retinal cells in rats that underwent subretinal injection of either fluorescein or an AAV2/5 vector containing the GFP-gene under control of a CMV promoter.Methods: Assessment of outer-plexiform-layer morphology by means of immunocytochemical labeling and laser scanning confocal microscopy as well as electron microscopy; quantification of OPL synapses; assessment of retinal gliosis; TUNEL-Assay.Results: In spite of the high plasticity of the retinal circuitry especially within the outer plexiform layer, where rod spherule retraction, dendritic sprouting and the formation of ectopic synapses between photoreceptors and second order neurons have been shown to be common responses to different types of retinal degeneration and retinal injury, no histologic abnormalities have been found in our study. The outer plexiform layers in both fluorescein-injected and GFP-transduced retinae showed a normal architecture and there were no signs of rod spherule retraction. No dendritic pruning was found in rod bipolar or horizontal cells and particularly no sprouting of second order neurite processes into the outer nuclear layer could be observed. Both rod spherules and cone pedicles and their respective invaginating and flat synaptic contacts seemed unaltered on an ultrastructural level. The overall number of synaptic contacts between rods and rod bipolar cells did not appear to be reduced. Although the temporary retinal detachment caused by the subretinal injection results in an upregulation of glial fibrillary acidic protein expression within retinal Müller cells, there were no signs of more severe forms of gliosis. There is no increase in apoptotic cell death within treated retinae.Conclusions: AAV-mediated transgene delivery via subretinal injection and expression of GFP as a transgene in photoreceptors do not inflict significant changes on retinal morphology nor do they lead to increased rates of apoptotic cell death. It seems therefore to be a safe and efficacious way for transgene delivery to outer retinal cells.