Generierung hochspezifischer Nukleasen für die zielgerichtete Spaltung genomischer DNA-Sequenzen

dc.contributor.authorYanik, Mert
dc.date.accessioned2023-03-03T14:44:13Z
dc.date.available2014-01-21T13:21:30Z
dc.date.available2023-03-03T14:44:13Z
dc.date.issued2013
dc.description.abstractHochspezifische Nukleasen haben sich im Bereich gene targeting und gene therapy zu unentbehrlichen Werkzeugen entwickelt. Eine auf Zufall basierte Integration von DNA-Sequenzen ins Genom verschiedener Organismen mit den damit verbundenen Nebenwirkungen kann mit Hilfe dieser Werkzeuge vermieden werden. Die Möglichkeit, ein Gen im Genom an einer definierten Position zu reparieren, ein- oder auszuschalten oder zu ersetzen, besitzt neben der therapeutischen Anwendung auch enormes Potential in der Grundlagen- wie auch in der angewandten Forschung. Die einzelnen Funktionen von Genen und deren Wechselwirkungen in einem Modellorganismus lassen sich damit sehr gut studieren. Damit vereinfacht sich auch die Züchtung von Pflanzen und Tieren. Die Basis der gängigsten Nuklease-Architekturen bildet das unspezifische Spaltmodul FokI, welches in Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) am häufigsten verwendet worden ist. Mit sogenannten TAL-Effektoren ist es gelungen, in einer vergleichsweise unkomplizierten Art und Weise spezifische Nukleasen, die sogenannten TALEN, zu generieren. Beide Architekturen lassen sich programmieren, neigen aber durch den FokI-DNA-Spalt-Mechanismus zu unerwünschten Reaktionen. In dieser Arbeit werden zwei alternative Spaltmodule zu FokI mit vielversprechenden Resultaten präsentiert. Die allosterische Aktivierung des BfiI-Restriktionsenzyms und die Charakterisierung der TALE-PvuII-Konstrukte. Mit BfiI-Varianten konnte die Bindung an die Wildtyp-BfiI-Erkennungssequenz unterbunden und ein Einzelstrangbruch mit Hilfe von in cis gebundenen Bindungsmodulen durchgeführt werden. Die Toxizität des BfiI-Fusionsenzyms ist extrem vermindert, da eine katalytische Aktivität nur durch die langen Erkennungssequenzen der Bindungsmodule dirigiert wird. Weitere Untersuchungen hinsichtlich heterodimerer Varianten werden genauere Aussagen über ihren Nutzen treffen können.Das TALE-PvuII-Fusionskonstrukt spaltet nur adressierte TALE-PvuII-Erkennungssequenzen und zeigt keine Aktivität gegenüber isolierten PvuII-Sequenzen, trotz Enzymüberschusses und langen Inkubationszeiten. Die in vitro-Spaltungskinetiken zeigten, dass die Präferenz für eine adressierte Sequenz gegenüber einer nicht-adressierten Sequenz bei einem Faktor > 34.000 liegt. Darüber hinaus sind die TALE-PvuII-Konstrukte in HEK293-Zellen aktiv und weisen nur eine minimale Zytotoxizität auf. Zusammen mit den vielversprechenden heterodimeren TALE-PvuII-Varianten bleibt ihre Effektivität auf die Anwendung chromosomaler Sequenzen abzuwarten.de_DE
dc.identifier.urihttp://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-105814
dc.identifier.urihttps://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/10892
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10275
dc.language.isode_DEde_DE
dc.rightsIn Copyright*
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/page/InC/1.0/*
dc.subjecthochspezifische Nukleasede_DE
dc.subjectGentherapiede_DE
dc.subjecthighly specific nucleasesen
dc.subject.ddcddc:570de_DE
dc.titleGenerierung hochspezifischer Nukleasen für die zielgerichtete Spaltung genomischer DNA-Sequenzende_DE
dc.typedoctoralThesisde_DE
dcterms.dateAccepted2013-12-13
local.affiliationFB 08 - Biologie und Chemiede_DE
local.opus.fachgebietBiochemie (FB 08)de_DE
local.opus.id10581
local.opus.instituteInstitut für Biochemiede_DE
thesis.levelthesis.doctoralde_DE

Dateien

Originalbündel
Gerade angezeigt 1 - 1 von 1
Lade...
Vorschaubild
Name:
YanikMert_2013_12_13.pdf
Größe:
7.19 MB
Format:
Adobe Portable Document Format