Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung neuartiger Oxidoreduktasen aus Basidiomyceten

Abstract

Die native Oxygenase aus Pleurotus sapidus, welche die selektive allylische Oxidation von (+)-Valencen zu (+)-Nootkaton katalysiert, wurde proteinbiochemisch charakterisiert. Das Enzym liegt intrazellulär vor und weist ein Molekulargewicht von 76 kDa und einen pI von 5,81 auf. Die Oxygenase wurde hinsichtlich der Stabilität in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer und verschiedenen Zellaufschlusstechniken untersucht. Die höchste Produktkonzentration an (+)-Nootkaton wurde durch den Aufschluss mittels Rührwerkskugelmühle erzielt. Sowohl die Transformationsaktivität als auch das Proteinbandenmuster des PSA-Myzels wurden mit der Aktivität und dem Bandenmuster des Fruchtkörpers verglichen. Des Weiteren wurden die Aktivitäten der Enzyme aus Pleurotus sapidus, Pleurotus ostreatus und Pleurotus eryngii gegenüber (+)-Valencen und deren Proteinbandenmuster untersucht und verglichen. Die cDNA der Oxygenase aus Pleurotus sapidus wurde in Vorarbeiten isoliert und von ARTES Biotechnology GmbH heterolog in Hansenula polymorpha exprimiert. Die kodierende Gesamtsequenz des Enzyms wurde dabei jedoch nicht vollständig isoliert. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit die cDNA-Sequenz der Oxygenase erneut isoliert und das Enzym heterolog exprimiert. Die höchsten Homologien auf Basis der Aminosäuresequenz wurden zu einer postulierten Lipoxygenase aus Pleurotus ostreatus nachgewiesen. Bei der heterologen Expression durch ARTES Biotechnology GmbH wurde lösliches aber inaktives Enzym erhalten. Deswegen wurde die rekombinante Oxygenase mittels iFOLD® Protein Refolding System-Kit rückgefaltet; trotz Proteinrückfaltung wurde kein aktives Enzym erhalten. Mittels Real-time-PCR wurde die Untersuchung der Expression der Oxygenase in den Seitlingen Pleurotus sapidus, Pleurotus ostreatus und Pleurotus eryngii vorgenommen. Als Proben-Templates wurden die cDNA-Erststränge (ss) von P. sapidus, P. eryngii und P. ostreatus der unterschiedlichen Kulturtage eingesetzt. Die Anzahl der Transkripte der Oxygenase in dem Basidiomyceten Pleurotus sapidus betrug von 25 bis 71 Kopien ng^& #8722;1 cDNA(ss). Die Anzahl in Pleurotus eryngii und Pleurotus ostreatus lag wesentlich niedriger. Die rekombinante Peroxidase MsP1 aus Mycetinis scorodonius wurde bei der Firma DSM in Aspergillus niger erfolgreich überexprimiert und ist die erste heterolog exprimierte DyP-Typ-Peroxidase aus der Familie der Schwindlingsverwandten. Um MsP1 von dem Kulturüberstand abzutrennen, wurde eine geeignete Reinigungsmethode mittels FLPC entwickelt. Die gereinigte DyP-Typ-Peroxidase wurde proteinbiochemisch charakterisiert und deren kinetische Parameter für unterschiedlichste Substrate bestimmt. Das aktive Enzym liegt im Gegensatz zu anderen DyP-Typ-Peroxidasen als Dimer vor. MsP1 weist eine hohe Thermostabilität auf. Das pH-Profil des Enzyms zeigte, abhängig von den eingesetzten Substraten, Aktivitätsmaxima zwischen pH 2,5 und 4,5. Neben dem Einfluss von Wasserstoffperoxid wurde auch der Einfluss von Sauerstoff auf die Enzymaktivität von MsP1 untersucht. MsP1 oxidiert ß-Carotin auch in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid, wobei die Enzymaktivität durch die Zugabe von H2O2 signifikant gesteigert werden kann. Des Weiteren wurde die Enzymaktivität gegenüber ß-Carotin durch die Anreicherung des Reaktionspuffers mit Sauerstoff um den Faktor 2,3 gesteigert. Dies deutet darauf hin, dass MsP1 neben der Peroxidase- auch eine Oxidasefunktion aufweist. Das ermittelte Substratspektrum des Enzyms umfasste neben natürlichen Farbstoffen und dem charakteristischen DyP-Typ-Substrat auch bekannte Substrate für polyvalente Peroxidasen und Mangan- bzw. Ligninperoxidasen. Die Fähigkeit von MsP1, Mn2+ zu oxidieren, ist außergewöhnlich und wurde bisher nur für eine weitere DyP-Typ-Peroxidase aus Pilzen beschrieben. Zur Rückgewinnung von MsP1 aus technischen Prozessen wurde reines MsP1 mit Hilfe kovalenter chemischer Bindungen an Oberflächen von Silica-Monolithen und Polystyrolkugeln immobilisiert. Zum einen erfolgte die Immobilisierung mit Glutardialdehyd; zum anderen durch eine chemische Aktivierung der Oberflächengruppen mit N-(3-Dimethylaminopropyl)-N -ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS). Mit Hilfe von Glutardialdehyd wurden zwar geringe Mengen des gereinigten MsP1 an die verwendeten Silica-Monolithen immobilisiert; jedoch führte die anschließende Reduktion der Schiffschen Base mittels Natriumborhydrid zu einer Inaktivierung des Enzyms. Mit Hilfe von EDC und NHS wurde aktives MsP1 erfolgreich an Silica-Monolithen und Polystyrol-Kugeln immobilisiert. Von diesen Materialien wurde die Wiederverwendbarkeit sowie die Lagerstabilität überprüft. Weiterhin wurden sie zur Bleichung von Molke eingesetzt. Immobilisiertes MsP1 bleichte sowohl den durch Annattozusatz gefärbten Natriumacetat-Puffer, als auch die gefärbte Molke innerhalb von 12 Stunden. Das Resultat der Bleichung war vergleichbar mit dem Resultat der Bleichung durch nicht immobilisiertes, aktives Enzym. The native oxygenase from Pleurotus sapidus, which catalyses the selective allylic oxidation of (+)-valencene to (+)-nootkatone, was biochemically characterised. The enzyme, which exists intracellular, has a molecular mass of 76 kDa and a pI of 5.81. The stability of the oxygenase was examined in matters of storage duration and different cell disruption techniques. The highest product concentration of (+)-nootkatone was achieved by using an agitator bead mill. Both, the transformation activity and the protein pattern of the PSA mycelium were compared with the activity and protein pattern of the fruiting body. In addition, the enzyme activities of Pleurotus sapidus, Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii towards (+)-valencene as well as their protein patterns were examined and compared. The cDNA of the oxygenase was isolated in a previous study and heterologously expressed in Hansenula polymorpha by ARTES Biotechnology GmbH. However, in the previous study the entire coding sequence of the enzyme was not fully isolated. Therefore, the cDNA of the oxygenase was isolated again and the enzyme was heterologously expressed a second time. The highest homologies on the basis of the amino acid sequence were detected with a postulated lipoxygenase from Pleurotus ostreatus. From the heterologous expression performed by ARTES Biotechnology GmbH, a soluble but inactive enzyme was obtained. Due to that, the recombinant oxygenase was refolded by means of an iFOLD® Protein Refolding System-Kit. However, despite refolding, no active enzyme could be obtained. The expressions of the oxygenases from Pleurotus sapidus, Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii were studied by means of Real-time-PCR. The cDNA-first-strand (ss) of P. sapidus, P. eryngii and P. ostreatus of the different culture days were used as templates. The number of transcripts of the oxygenase from the basidiomycete Pleurotus sapidus amounted to values between 25 and 71 copies ng^-1 cDNA(ss). However,the numbers in Pleurotus eryngii and Pleurotus ostreatus were considerably lower. The successful amplification of the representative fragments of the oxygenase was proven and confirmed by sequencing of the nucleotide sequence. The recombinant peroxidase MsP1 from Mycetinis scorodonius was successfully overexpressed in Aspergillus niger by DSM and is the first heterologously expressed DyP-type peroxidase from the Pleurotus species. In order to separate MsP1 from the supernatant, an appropriate purification method by means of FPLC was developed. The purified DyP-type peroxidase was biochemically characterised and the kinetic parameters for different substrates were determined. In contrary to other DyP-type peroxidases, the active enzyme MsP1 is a dimer which showed a high thermostability. Depending on the substrate, the pH profile showed maximum activities in the range of pH 2.5 to 4.5 and is therefore comparable with pH profiles of other DyP-type peroxidases. Additional to the influence of hydrogen peroxide the influence of oxygen on the enzyme activity of MsP1 was investigated. MsP1 oxidises & #946;-carotene even in absence of hydrogen peroxide, whereby the enzyme activity can be raised significantly by the addition of H2O2. Furthermore, the enzyme activity towards & #946;-carotene was increased by the factor of 2.3 by enriching the reaction buffer with oxygen. This indicates a possible oxidase function in addition to the peroxidase function. The identified substrate spectrum includes known substrates for versatile peroxidases, manganese peroxidases and lignin peroxidases besides natural colouring agents and characteristic DyP-type substrates. The ability of MsP1 to oxidise Mn2+ is exceptional and was reported for only one other fungal DyP-type peroxidase. To recover MsP1 from technical processes, the enzyme was immobilised onto the surfaces of silica monoliths and polystyrene balls. The immobilisation was achieved by glutaraldehyde used as homobifunctional cross linker as well as by chemical activation of the surface groups by 1-(3-di- methylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), followed by the formation of stable amide bonds. By means of glutaraldehyde, small amounts of MsP1 were immobilised on the silica monoliths. However, the subsequent reduction of the Schiff base using sodium borohydride led to an inactivation of the enzyme. By the help of EDC and NHS active MsP1 was successfully immobilised on silica monoliths and polystyrene balls. These materials were tested with regard to their reusability and storage stability; additionally, they were used to bleach whey. In summary, immobilised MsP1 bleached sodium acetate buffer coloured by annatto, as well as coloured whey within 12 hours. The result of the bleaching was comparable to the result of the bleaching by non-immobilised active enzyme.