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Item type:Item, Analysis of Hepatitis C Virus cis-elements involved in the Initiation of Negative-Strand RNA Synthesis(2026-03) Malik, Attiya QadoosHepatitis C Virus infects approximately 3 % of the global population. Because infection often remains asymptomatic for long periods, many cases progress unnoticed to severe liver diseases such as cirrhosis, hepatocellular carcinoma or chronic liver failure. HCV possesses a positive-strand RNA genome that replicates via negative-strand RNA intermediate. While many aspects of HCV replication are well studied, comparatively little is known about the cis-acting RNA elements on the positive-strand genome that are involved in the initiation of negative-strand RNA synthesis. Studying negative-strand RNA synthesis poses major technical challenges, particularly due to background signals that obscure accurate detection. The background signals arise from false priming (1) during in vitro-transcription and (2) during reverse transcription due to the strong hairpin structure at the 3´end of the RNA genome and (3) contaminating residual plasmid DNA and transfected RNA that serves as a false template during cDNA synthesis. Furthermore, it is essential to measure negative-strand RNA synthesis uncoupled from other viral processes such as translation and positive-strand RNA replication. To address these challenges, an HCV subgenomic (4th generation) replicon system was developed combined with a highly optimized strand-specific RNA detection assay. The system allows precise detection of newly synthesized negative-strand RNA with negligible background. Template DNA contamination from in vitro-transcribed RNA was (nearly) completely eliminated by two rounds of DNase digestion followed by RNA purification using Monarch kit columns. Total RNA extracted using TRIzol also underwent additional DNase treatments, acidic phenol/chloroform extraction and column-based purification to further enhance RNA quality. To selectively detect RNA new transcribed only after transfection of the replicon, 5EU-labelling was used in combination with Click iT chemistry. The 5EU-labelled nascent RNA was biotinylated, captured using streptavidin beads, and subjected to ten stringent washing steps before analysis by RT-qPCR. High temperature conditions during reverse transcription (65 °C) and qPCR (62 °C) further minimized nonspecific amplification. This approach reduced the background signals from polymerase deficient negative controls to only 0.02 - 0.035 %, representing an approximately 975-fold improvement over earlier methods in the Niepmann laboratory using 1st generation replicon system and conventional RNA purification procedures. Using this highly sensitive platform, the study identified the SLI-II region of the HCV 5´UTR as the minimal essential cis-acting element required for the initiation of negative-strand RNA synthesis. The SLI-III domain, which comprises the IRES region of the HCV 5´UTR, supported about 34.5 % of the overall efficiency of the negative-strand RNA synthesis. In contrast, mutations disrupting binding of eIF3 or the 40S subunit (∆IIIb and mutIIId/e) caused a drastic reduction in negative-strand RNA levels, both in SLI-III as well as in complete 5´UTR construct. These findings underscore the essential role of an intact HCV 5´UTR in genome replication and suggest that recruitment of eIF3 and the small ribosomal 40S subunit positively regulate negative-strand RNA synthesis. Similar to the PCBP2 protein, these factors may bridge the 5´- and 3´-ends of the viral genome, promoting genome circularization. Competitive binding of NS5B dimer or oligomer to the 5´UTR may disrupt this interaction, enabling replication via NS5B binding to the 3´-end. Such interactions may function as a checkpoint determining whether the genome undergoes translation and/or replication. Detection of negative-strand RNA is currently reliable only from 24 hpt onward, and further optimization is required to analyse initiation events at earlier time points.Item type:Item, Klinische Bewährung von Freiendbrücken unter besonderer Berücksichtigung der gesetzlichen Vorgaben in der vertragszahnärztlichen Versorgung(2025) Rau, Katharina MariaZiel: Mit der vorliegenden retrospektiven Longitudinalstudie sollte die klinische Bewährung von Freiendbrücken, unter Berücksichtigung verschiedener Einflussfaktoren und der gesetzlichen Vorgaben in der vertragszahnärztlichen Versorgung, untersucht werden. Material und Methode: Aus einem Patientenkollektiv von über 25.000 Patienten der Poliklinik für Zahnärztliche Prothetik der Justus-Liebig-Universität Gießen wurden mithilfe eines internen EDV-Programmes (Multizentrische Dokumentation) 72 Patienten mit insgesamt 79 Freiendbrücken herausgefiltert, die den Einschlusskriterien entsprachen. Der Untersuchungszeitraum erstreckte sich dabei von September 2005 bis Oktober 2024. Zur statistischen Analyse der Daten wurde die Überlebenszeitanalyse nach Kaplan-Meier mit Gruppenvergleichen durchgeführt. Zum Vergleich statistischer Signifikanzen der neun untersuchten Faktoren wurde der von SPSS angebotene Log-Rank-Test, Breslow-Test sowie der Tarone-Ware-Test verwendet. Ergebnisse: Bei 79 Freiendbrücken und 72 Patienten lag die mittlere Beobachtungsdauer bei 5,44 ± 4,42 Jahren. Der längste dokumentierte Zeitraum erstreckte sich über 17,03 Jahre. Alle neun Variablen, die betrachtet und in die Statistik mit einbezogen wurden, hatten keinen signifikanten Einfluss (p>0,05) auf die Überlebenswahrscheinlichkeit der Freiendbrücken. Mithilfe der Überlebenszeitanalyse konnte eine mittlere Überlebenszeit von 13,49 ± 0,90 Jahren ermittelt werden bei einem Konfidenzintervall von 11,73 bis 15,26 Jahren. Die 5-Jahres-Überlebensrate betrug 85,6%, nach 10 sowie nach 15 Jahren lag sie bei 68,2%. Eine Unterschreitung der 90%igen Überlebenswahrscheinlichkeit fand nach 4,85 Jahren statt, während die 50%ige Überlebenswahrscheinlichkeit nicht unterschritten wurde. Das durchschnittliche Patientenalter bei Eingliederung lag bei 57,48 ± 14,28 Jahren. Insgesamt wurden 12 (15,19%) Freiendbrücken im Verlauf funktionsuntüchtig. Zudem wurden drei Retentionsverluste dokumentiert.Item type:Item, To Strepto and beyond! Large-scale bacterial genomics with a focus on pathogenic streptococci(2026-03) Fenske, LindaBacteria are central research organisms across many disciplines and capturing their diversity is essential for understanding their genomic features, which in turn illuminate virulence, transmission, and the rapid evolution and spread of antimicrobial resistance. Advances in whole-genome sequencing has driven an explosion of publicly available data, with thousands of new datasets deposited daily. However, despite broad data availability, major hurdles remain in terms of accessibility and comparability due to heterogeneous processing pipelines, inconsistent quality control, and incomplete or unstructured metadata.<br> *Streptococcus agalactiae* is an opportunistic multi-host pathogen with major relevance in both human and veterinary medicine. Beyond humans and cattle, *S. agalactiae* has also been reported in endangered species such as elephants, but elephant-associated strains lack detailed genomic characterization to date. Although extensively studied, existing genomic work is often restricted to specific regions or single outbreaks, offering only fragmented views of its true diversity.<br> This thesis addresses these challenges through three linked projects, motivated by an interest in the diversity of *S. agalactiae*. Initial attempts to perform a large-scale comparative analysis of *S. agalactiae* were hampered by the lack of suitable reference datasets. To enable robust comparative genomics from uniformly processed public data, BakRep was developed: A large-scale, searchable web repository built on the assemblies from the *AllTheBacteria* project. BakRep connects consistent genomebased characterizations, like taxonomic information, subtypings and annotations, with descriptive metadata and provides an integrated search interface complemented by interactive visualizations of genomic features. As a use case, BakRep was used to conduct a population-scale comparative analysis of all *S. agalactiae* genomes in the repository, confirming dominant stable lineages while exposing substantial metadata gaps that limited biological interpretation and highlighted the need for curated, structured metadata. Additionally, isolates from elephant-derived *S. agalactiae* were analyzed, to address the present date deficit.<br> These isolates were phylogenetically distinct from strains found in other hosts, and several lineage-specific genes suggested potential niche adaptation. Together, this work demonstrates how consistent, scalable resources support large-scale comparative studies across thousands of bacterial species to identify shared patterns of adaptation, virulence, as well as resistance, to guide focused follow-up research in lesser-studied hosts and ecological niches. While comparative genomics is crucial for understanding genetic variation and host adaptation in multi-host pathogens like *S. agalactiae*, its impact is undermined when sequencing data are generated and shared without well-curated metadata. Such metadata gaps present significant obstacles to biological interpretation and clinical translation, thereby necessitating rigorous data and metadata quality control. Furthermore, this work identified opportunities to enhance methods devised here, highlighted new research questions, and set a foundation for future investigations.Item type:Item, Vergleich verschiedener Färbemethoden von aufgetautem Tiefgefrier-Rüdensperma(2026) Klumb, Indra SaraDie vorliegende Studie vergleicht sechs etablierte Färbemethoden (Eosin, Eosin-Nigrosin, Diff-Quick®, Hemacolor®, Spermac®, Formolzitrat-Bengalrosa) für die lichtmikroskopische Untersuchung kryokonservierter Rüdenspermien. Nach dem Auftauen wurden die Proben von zehn Rüden in vier Fraktionen aufgeteilt und entweder keinem oder einem zweistündigen Stresstest bei 6 °C, 18 °C oder 37 °C unterzogen. Ziel war es, die pathomorphologische Varianz für eine bessere Aussagekraft der Untersuchungsergebnisse zu erhöhen. Im Anschluss wurden gefärbte Samenzellpräparate angefertigt und sowohl eine pathomorphologische Begutachtung als auch eine Beurteilung der Färbequalität unmittelbar nach der Präparation durchgeführt. Wiederholungsuntersuchungen zur Lagerungsstabilität erfolgten nach 24 Stunden, 7 Tagen und 3 Monaten. Ergänzend wurde das CASA-System AndroVision® eingesetzt. Pro Färbemethode wurden 40 (Eosin, Diff-Quick®, Hemacolor®) bzw. 80 Präparate (Eosin-Nigrosin, Spermac®, Formolzitrat-Bengalrosa) erstellt. Die Gesamtanalyse umfasste 360 Präparate mit 960 Evaluationsprozessen. Dabei ergaben sich folgende wesentliche Erkenntnisse: Eosin - Färbequalität: gute Farbintensität, Detailerkennbarkeit und Kontrast, stabil über 3 Monate. - Im Vergleich: Detailerkennbarkeit: zu t0 signifikant schlechter als Spermac® und Formolzitrat-Bengalrosa (jeweils p = 0,029). - Zeitaufwand: schnellste Methode mit mittlerem Arbeitsaufwand zur Präparation und Beurteilung je Objektträger von 8,15 ± 0,36 Min. (mit Vitalitätsbeurteilung +5,29 ± 0,22 Min.). - Kosten: günstigste Methode mit 0,13 € je Präparat für Verbrauchsstoffe; 1,85 € inklusive Personalkosten (mit Vitalitätsbeurteilung +1,12 €). - Stresstest: signifikant mehr rudimentäre Schwänze bei 37 °C im Vergleich zu ungestressten Proben. - Lagerungsstabilität: keine relevanten Veränderungen der Pathomorphologie. - Besonderheiten: sehr gut für die Routinediagnostik geeignet, sofern keine Beurteilung des Akrosoms benötigt wird. Eosin-Nigrosin - Färbequalität: gute Farbintensität; leicht unterdurchschnittliche Detailerkennbarkeit und Kontrast. - Im Vergleich: signifikant schlechtere Detailerkennbarkeit als Spermac®- und Formolzitrat-Bengalrosa-Färbung; schlechterer Kontrast als Diff-Quick®, Spermac® und Formolzitrat-Bengalrosa (jeweils p = 0,029). - Zeitaufwand: 10,54 ± 0,50 Min. (mit Vitalitätsbeurteilung +5,45 ± 0,28 Min.). - Kosten: 0,26 € Verbrauchsstoffe; 2,49 € inklusive Personalkosten (mit Vitalitätsbeurteilung +1,15 €). - Stresstest: signifikant mehr Pathomorphologien bei 37 °C im Vergleich zu ungestressten Samenzellen (p = 0,012). - Lagerung: keine maßgeblichen Veränderungen der Pathomorphologie oder Qualitätsparameter. - Besonderheiten: feine Strukturen (Schwanzenden) teils nur mit erhöhtem Zeitaufwand beurteilbar, daher eingeschränkt für fein graduierte morphologische Beurteilung geeignet. Diff-Quick® - Färbequalität: gute Detailerkennbarkeit, mittlere Farbintensität und sehr guter Kontrast. - Im Vergleich: signifikant höherer Kontrast als bei Eosin-Nigrosin (p = 0,029). - Pathomorphologie: niedrigster Anteil pathomorphologischer Veränderungen (Md = 13,75 %); signifikant weniger Schleifenformen als bei Spermac® (p = 0,029). - Zeitaufwand: 10,24 ± 0,38 Min. - Kosten: 0,46–0,91 € Verbrauchsstoffe, abhängig vom Verbrauch der Farblösungen; 2,63–3,08 € inklusive Personalkosten. - Stresstest und Lagerung: keine signifikanten Effekte auf Pathomorphologie-Prävalenzen oder Färbequalität. - Besonderheiten: robuste und schnelle Methode, die sich bei niedrigem Farbstoffverbrauch für Labore mit hohem Probenaufkommen eignet. Hemacolor® - Färbequalität: gute Farbintensität, Detailerkennbarkeit und Kontrast; vereinzelt hohe Variabilität der Farbintensität (blass) ohne Beeinträchtigung der Beurteilbarkeit. - Zeitaufwand: 10,46 ± 0,32 Min. - Kosten: 0,69–2,28 € Verbrauchsstoffe, abhängig vom Verbrauch der Farblösungen; 2,90–4,49 € inklusive Personalkosten. - Stresstest und Lagerung: keine signifikanten Effekte auf Pathomorphologie-Prävalenzen oder Färbequalität. - Besonderheiten: beständige und schnelle Ergebnisse; wirtschaftlich jedoch nur bei niedrigem Verbrauch der Farblösungen oder geringer Priorität der Wirtschaftlichkeit sinnvoll. Spermac® - Färbequalität: beste Ergebnisse aller Methoden zu t0. - Im Vergleich: signifikant bessere Detailerkennbarkeit im Vergleich zu Eosin und Eosin-Nigrosin; signifikant höherer Kontrast als Eosin-Nigrosin (jeweils p = 0,029). - Pathomorphologie: höchste Prävalenz schleifenförmiger Spermien (Md = 8,75 %); signifikant mehr als bei Diff-Quick® (p = 0,029). - Zeitaufwand: sehr zeitintensiv mit 29,91 ± 0,33 Min. - Kosten: 1,04 € Verbrauchsstoffe; 7,37 € inklusive Personalkosten. - Stresstest: für rudimentäre Schwänze signifikanter Unterschied zwischen 37 °C (Md = 1,75 %) und 18 °C (Md = 3,5 %, p = 0,047). - Lagerung: signifikante Qualitätsverluste aller Parameter (Farbintensität: t0 im Vergleich zu t1/t3; Detailerkennbarkeit und Kontrast: t0 im Vergleich zu den drei Wiederholungsuntersuchungen); vereinzelt Pigmentverlust. - Besonderheiten: insgesamt geringste Häufigkeit an Artefakten; sehr gut zur unmittelbaren pathomorphologischen Beurteilung inklusive Akrosom geeignet; aufgrund des Zeit- und Kostenaufwands für die Routinediagnostik nur eingeschränkt empfehlenswert. Formolzitrat-Bengalrosa - Färbequalität: durchweg hohe Mediane in allen Parametern. - Im Vergleich: bessere Detailerkennbarkeit im Vergleich zu Eosin und Eosin-Nigrosin; höherer Kontrast als Eosin-Nigrosin (jeweils p = 0,029). - Pathomorphologie: höchste Prävalenz pathomorphologischer Veränderungen (Md = 22,25 %); gehäuft lanzenförmige Spermienköpfe bei direkter Auswertung (Md = 2,25 %) als Artefakt unzureichend abgeflachter Spermienköpfe, die nach Lagerung nicht mehr auftraten. - Zeitaufwand: durch 30-minütige Lagerungsphase mit 36,00 ± 0,33 Min. zeitaufwändigste Methode. - Kosten: 0,24 € Verbrauchsstoffe; 7,85 € inklusive Personalkosten. - Stresstest und Lagerung: keine signifikanten Effekte auf Pathomorphologie oder Färbequalität; nach dreimonatiger Lagerung höchste Qualitätsparameter. - Besonderheiten: aufgrund sehr guter Färbequalität und Lagerstabilität für präzise pathomorphologische Analysen geeignet; bei effizienter Integration in Laborabläufe zeitsparender als und kostentechnisch vergleichbar mit Eosin, jedoch mit höherer Färbequalität. Alle Präparate waren zu allen vier Auswertungszeitpunkten auswertbar, sodass sich die sechs Färbemethoden zur Archivierung kryokonservierter Rüdenspermien eignen. Die computergestützte Spermienanalyse (AndroVision®) konnte nicht erfolgreich eingesetzt werden. Infolge der Kryokonservierung wurden vermehrt Schleifenformen, jedoch seltener gebrochene/geknickte Schwänze oder abgelöste Köpfe identifiziert, was möglicherweise methodisch begründet ist. Die Stresstests beeinflussten die Färbequalität nicht, jedoch induzierte der Stresstest bei 37 °C signifikant höhere mediane Anteile pathologischer Auffälligkeiten im Vergleich zu ungestressten Samenzellen (Gesamtanteil pathologischer Spermien: p = 0,012; rudimentäre Schwänze: p = 0,035).Item type:Item, Exploring the Interactions and Functional Implications of Dbp2 and the RSC Complex in Schizosaccharomyces pombe(2025) Böhme, JacquelineTranscription is a fundamental process by which genetic information encoded in DNA is transcribed into RNA, representing a crucial step in gene expression. This process is regulated by a variety of factors that influence both the activity and accessibility of DNA. One of the central mechanisms that control transcription is the remodeling of chromatin by dedicated complexes, which modulate transcriptional activity through alterations in chromatin structure, either in an activating or repressive manner. The RSC complex is involved in various cellular processes, particularly transcriptional regulation. Dbp2, an RNA helicase with diverse biological functions, is critical in mRNA processing and other RNA-related processes. In light of their potential interaction, this study investigates the functional connection between Dbp2 and the RSC complex in Schizosaccharomyces pombe. To this end, a modified auxin-inducible depletion system was successfully established, enabling inducible and rapid depletion of the RSC complex's essential subunit Snf21. Our results suggest an interaction between Dbp2 and the RSC complex in the nucleoplasm. Interestingly, however, the two components act independently concerning their cellular localization and function. Notably, the loss of Dbp2 results in impaired mRNA export, while the loss of the RSC complex does not directly affect this process. Furthermore, the influence of the RSC complex on gene expression was characterized in greater detail to thoroughly investigate its functional roles in transcriptional regulation and identify potential target genes. Through PolⅡ-ChIP-Seq experiments, we identified a surprising repressive effect of the RSC complex on various target genes, particularly those located near the telomeres. These findings provide new insights into the function of chromatin remodeling complexes and their role in transcriptional regulation. Our results contribute to the broader understanding of chromatin-based genome regulation and open new avenues for exploring the functional diversity of these complexes.