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JLUpub ist das institutionelle Repositorium der Justus-Liebig-Universität.
JLUpub bietet Mitgliedern und Angehörigen der Universität die Möglichkeit neben wissenschaftlichen Dokumenten auch Forschungsdaten elektronisch zu veröffentlichen und dauerhaft zugänglich zu machen. Alle Veröffentlichungen erhalten einen Digital Object Identifier (DOI) und werden über nationale und internationale Bibliothekskataloge sowie Suchmaschinen nachgewiesen und auffindbar.
Neue Veröffentlichungen:
Etablierung einer ex vivo Organkultur zur Untersuchung der regionenspezifischen Immunantwort des Nebenhodens
(2024) Bohnert, Daniel
Entzündungen des Nebenhodens gehören zu den häufigen Konsultationsgründen der Urologie und stellen weltweit eine der führenden Ursachen für männliche Infertilität dar. Der Nebenhoden bildet einen Teil der abführenden Samenwege, in dem die Spermien durch intensive Interaktion mit dessen Sekretionsprodukten ihre Motilität erlangen. Darüber hinaus kommt dem Nebenhoden eine duale Rolle zur Wahrung des immunologischen Gleichgewichts zu. Gegenüber aus dem immunprivilegierten Testis stammenden immunogenen Spermatozoen muss eine Immuntoleranz gewährleistet werden, während in distalen Regionen über die Urethra aufsteigende Keime effektiv bekämpft werden müssen. Bisherige in vivo Modelle demonstrieren eine fundamental divergierende Immunreaktion der verschiedenen Regionen und zeigen histologisch massive Gewebeschäden in der Cauda, während der Caput kaum betroffen ist. Die Frage, ob diese auf der unterschiedlichen Expositionsdauer mit Erregern beruhen oder ob das jeweilige Gewebe abweichend auf Infektionen reagiert, wurde in bisherigen Studien nicht ausreichend beantwortet. Zunächst wurde mithilfe eines ex vivo Modells empirisch die geeignete LPS-Dosis zur Inkubation der separierten Organregionen für nachfolgende qPCR Experimente ermittelt, wobei mit einer Gesamtdosis von 50 ng LPS gute Ergebnisse erzielt wurden. In der Cauda wurde die mRNA inflammatorischer Zytokine (Tnf, Il1a, Il6 und Il10) erhöht exprimiert, eine Beobachtung die mit erhöhten Proteinkonzentrationen inflammatorischer Zytokine (TNF, IL1A, IL6, Il10, IFNB und MCP1) einherging. Neben der Inkubation mit LPS wurden die zuvor mechanisch separierten Organregionen auch mit UPEC/NPEC inkubiert. Während NPEC eine Immunantwort auslösten, resultierten UPEC-Infektionen in einer partiellen Immunsuppression. In einem weiteren Experiment wurde der Anteil intrazellulärer UPEC nach simultaner Inkubation der separierten Organregionen mit UPEC und Gentamicin untersucht, wobei in proximalen Regionen eine größere Menge CFU detektiert wurde. In Zusammenschau der einzelnen Experimente wurde bestätigt, dass die Immunreaktionen in den verschiedenen Regionen stark voneinander divergieren. Da ex vivo, im Gegensatz zu in vivo, eine exakt gleiche Expositionsdauer gegenüber Erregern erzeugt werden kann, wird postuliert, dass die Unterschiede in der Immunantwort aus den großen Differenzen der im Verlauf des Ganges strategisch gruppierten Immunzellen resultieren.
Development of Components for Barrier-Free Pupillometry
(2023) Gdoura, Ahmed
Investigating the pupillary light reflex (PLR) toward a predefined light stimulation protocol as an indicator of the retinal state and the function of their photoreceptors remains a common practice among ophthalmologists. Apart from being a diagnostic tool, PLR could also reveal therapeutic progression and monitor its influence on inherited retinal degeneration (IRDs). However, the classical form of this examination presumes a minimum level of cooperation from the patient. Therefore, because some genetic mutations could manifest early, a successful PLR-based investigation suggests adapting this examination for patients from infancy.
In classical pupilometers, automatic extraction of pupil size is achievable via classical image processing methods due to the straightforward environment of the acquired eyecentered images. Extending pupillography systems to integrate a broader spectrum of patients suggests equipping its processing technics with convenient tools to tolerate the non-cooperation situation. The degree of cooperation is measured by the ability of the patient to maintain some degree of head and eye stillness during the measurement sessions. Therefore, non-cooperative patients, such as infants, are recognized by the new image space integrating several sources of variability due to their free head pose and eye behavior.
In the last decade, deep learning (DL) has emerged as a powerful approach to computer vision tasks, in contrast to classical methods. This is because DL models could extract the necessary features from complex background images, resulting in significant success in the computer vision field. In this work, the problem of extending pupillometry to integrate very young patients is approached by exploiting DL techniques. This will be achieved by providing an end-to-end solution that automates the collection of PLR information from non-cooperative patients. First, Convolution Neural Network (CNN) is employed to reduce the image space complexity to the traditional eye-centered one. Second, to achieve accurate PLR measurements, a novel post-processing algorithm is proposed that utilizes depth information to define pupil size at the subpixel level. Third, a decision support tool for enhancing the objectivity of the measurements is being proposed. This tool provides valuable gaze information for guessing the accommodation reflex which is a major factor in altering the PLR objectivity toward the predefined light stimulus. This is achieved via a second model leveraging DL techniques.
It is worth noting that each mentioned process was tested on publically available datasets and exhibited a satisfying performance adequate for the case of use. The pupil region extraction model achieved a Normalized Mean Error (NME) of around 4% on the 300w and the WFLW datasets.
The pupil size estimator was tested against three different datasets and performed an accuracy level of 76.04% and a precision level of 81.75% in the Swirski dataset.
In terms of the objectivity enhancement solution, the employed DENSNET achieved a mean error of 7.6◦ on the EVE dataset.
By integrating the aforementioned components into a pupillometry framework, increased flexibility in accommodating the patient’s behavior could be achieved. The structure of this thesis will revolve around three key components: pupil detection, pupil size estimation, and objectivity enhancement. These components will be presented in an alternating manner, discussing their foundations in the literature in Chapter 1, the methods employed in Chapter 2, and the performance measurements in Chapter 4. Furthermore, Chapter 3 provides detailed information about the materials used in the implementation and evaluation processes. To provide readers with more comprehensive information, appendices containing additional material on various aspects discussed in the main body of the text are included in Chapter A.
Identification and functional characterization of nuclear receptors with roles in the reproductive development and approaches to establish genome editing in Schistosoma mansoni
(2024) Möscheid, Max Frederik
Schistosoma mansoni is a parasite of humans and animals and causes the infectious disease schistosomiasis. Schistosomes are the only trematodes to have evolved separate sexes. Furthermore, females reach sexual maturity only if they are permanently paired with a male. Previous comparative transcriptomics studies of adult schistosomes and their isolated gonads have revealed that genes encoding type II nuclear receptors (NRs) are regulated in a pairing dependent and tissue-specific manner with a preference for the female ovary. Members of the nuclear receptor superfamily are ligand-activated transcription factors that play diverse roles in cell differentiation, development, and proliferation. In vertebrate systems, type II NRs, such as retinoic acid receptors (RAR/RXR) and thyroid hormone receptors (THR) have been reported to be involved in spermatogenesis, embryogenesis, and tissue homeostasis.
In the course of this work, potential S. mansoni NRs orthologs were identified and assigned to different NR classes as RAR (Smp_144170, SmRAR), RXR (Smp_097700, SmRXR-1), THRα (Smp_134490, SmTHRα), and THRβ (Smp_174260, SmTHRβ) based on polygenetic and comparative domain analyses. In addition, whole mount in situ hybridization (WISH) and functional analyses using RNA interference (RNAi) were performed to characterize these previously uncharacterized S. mansoni NR orthologs. Using WISH, transcripts of these receptors were found in the posterior part of the ovary. In addition, transcripts of these receptors dominated in oocytes at the intermediate stage of development, which was recently discovered by a new scRNA-Seq atlas of isolated ovaries of paired females, work performed by Zhigang Lu, a former member of the Grevelding lab. In my work, functional analyses provided first evidence for the involvement of these receptors in early embryogenesis and tissue homeostasis in adult schistosomes. Morphological analyses following RNAi revealed changes in the cellular structure of the ovary of paired females. In particular, RNAi against SmRAR and SmRXR-1 as well as biologically associated molecules, such as SmMEIOB and SmGLI1, strongly suggested essential roles of these genes in oocyte maturation and meiotic progression. These results as well as subsequent analyses of the influence of 9cis-retinoic acid on egg production suggest a critical role for RA signaling in the reproductive biology of S. mansoni.
The second aim of this project was to establish a CRISPR/Cas-based editing method for S. mansoni. Knock-out models are commonly used to study the function of a gene of interest (GOI). However, in the post-genomic era of schistosome research, there is no established protocol for stable transformation of this and other platyhelminth parasites. To date, RNAi has been the most appropriate method for functional gene characterization. Though, RNAi efficiency is variable and can lead to ectopic effects. CRISPR/Cas-based editing is a powerful tool for gene characterization. To make this technique accessible for trematode research, a protocol was established to edit a genomic safe harbor (GSH) site of S. mansoni, which was bioinformatically predicted before by our collaboration partner Professor Christoph Grunau (Perpignan) and named GSH1. GSHs represent distinct sites in the genome that tolerate the integration of new genetic material without compromising genome integrity or gene expression. Thus, GSHs should allow the constitutive expression of reporter-genes. In order to edit the identified candidate GSH1, a 5'C6-PEG10 modified construct encoding an eGFP-reporter gene under a strong native S. mansoni promoter was used as a donor repair template. Cas-mediated integration of the transgene was achieved by electroporation of eggs. To this end, Cas9 and Cas12a were used in a comparative approach. Sequence analyses post editing showed differences in the reporter gene-integration efficiencies between the two enzymes with a bias for Cas12a. Nonetheless, integration of the reporter-gene into GSH1 was demonstrated by PCR for both ribonucleoprotein complexes formed by Cas9 or Cas12a. Moreover, this work succeeded in transferring transgenic larvae into the parasitic life cycle. Finally, eGFP signals were detected in eggs and adult worms, which demonstrated reporter-gene activity at GSH1.
In summary, strong evidence was found for SmRAR and SmRXR-1 as key factors in the regulation of meiosis in S. mansoni. In addition, SmTHRβ and SmRXR-1 were shown to be critical for tissue homeostasis and oocyte formation. These findings suggest that these receptors and their ligands play a vital role in schistosome reproduction and indicating that the sexual maturation of females is not only influenced by pairing, but also by the host environment and thus by host derived molecules (e.g. RA and TH). Furthermore, the successful editing of the schistosomal GSH1 by transgene knock-in and the expression of the integrated eGFP reporter gene was achieved. By analyzing transgenic worms, strong evidence was found for transgene integration into germline cells. For the first time in schistosome research, these results provided proof of concept for a new genome editing approach in S. mansoni. This opens new perspectives to fill one of the existing technical gaps in schistosome research.
Einfluss des Rho/ROCK-Signalweges auf die TGF-β3-induzierte tenogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen
(2024) Melzer, Michaela
Mesenchymale Stromazellen (MSC) sind ein vielversprechendes therapeutisches Mittel zur Behandlung von Sehnenerkrankungen. Ihre tenogene Differenzierung ist für Tissue-Engineering-Ansätze von entscheidender Bedeutung und kann ihre positive Wirkung nach Zelltransplantation in vivo unterstützen. Der transformierende Wachstumsfaktor (TGF)-β, der über intrazelluläre Smad-Moleküle signalisiert, ist ein potenter parakriner Mediator der tenogenen Differenzierung. Darüber hinaus induzieren die extrazelluläre Matrix oder zyklische Dehnung die Tenogenese über die Aktivierung des Rho/ROCK-Signalweges, der jedoch auch an fehlerhaften Anpassungen bei Pathologien der extrazellulären Matrix beteiligt ist. Demnach ist die Rolle des Rho/ROCK-Signalwegs noch nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass die Rho/ROCK-Aktivität die Phosphorylierung von Smad2/3 und damit die tenogene Differenzierung beeinflusst. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Beeinflussung der TGF-β-induzierten tenogenen Differenzierung durch Rho/ROCK besser zu verstehen und die dem zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu beleuchten. Insbesondere Smad2/3 wird als mögliche Schnittstelle des Crosstalk zwischen den beiden Signalkaskaden betrachtet. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit ist der Vergleich der klinisch wichtigen Spezies Pferd und Mensch, um eine Grundlage für eine spätere Translation der Ergebnisse experimenteller In-vitro- und In-vivo-Studien zu schaffen.
In der ersten Studie wurden MSC aus humanem und equinem Fettgewebe isoliert und als Monolayer oder auf dezellularisierten Sehnenscaffolds kultiviert, um den Einfluss des ROCK-Inhibitors Y-27632 auf die TGF-β3-induzierte tenogene Differenzierung zu untersuchen. Die MSC wurden mit und ohne TGF-β3 (10 ng/ml), Y-27632 (10 μM) oder beiden Reagenzien inkubiert. An Tag 1 und 3 Tag wurden der TGF-β-Signalweg und das Aktinzytoskelett durch Smad2/3- und Phalloidin-Färbung visualisiert und die Genexpression von Signalmolekülen und Sehnenmarkern untersucht. In der zweiten Studie wurden ausschließlich humane MSC verwendet und das Sehnenscaffold durch eine Kollagen-I-Matrix ersetzt. Die Stimulation mit TGF-β und Y-27632, sowie die Kontrolle der Wirksamkeit des ROCK-Inhibitors mittels Phalloidin-Färbung erfolgten analog zur ersten Studie. Die Genexpression von tenogenen Markern und einem erweiterten Set an Signalmolekülen wurden ebenfalls am Tag 1 und 3 nach Stimulation analysiert. Zusätzlich erfolgte die Analyse der Phosphorylierungsstellen des Smad2 und Smad3 mittels Western Blot zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation. Die Ergebnisse zeigen, dass TGF-β3 den Smad2/3-Signalweg durch carboxy-terminale Phosphorylierung aktiviert, die Smad2/3-Kerntranslokalisation induziert und schließlich die Genexpression tenogener Marker steigert. Die Hemmung des Rho/ROCK-Signalwegs durch Y-27632 verstärkte die TGF-β3-induzierte Smad2/3-Kerntranslokalisation zusätzlich (p < 0,05 bei equinen MSC) und führte zu einer weiteren Erhöhung der Expression von Skleraxis (p < 0,05 bei humanen MSC). Die ROCK-Hemmung wurde in beiden Studien durch eine Zerstörung des Aktinzytoskeletts bestätigt. In der zweiten Studie wurde nachgewiesen, dass die ROCK-Hemmung die Smad2-Linker-Phosphorylierung nicht beeinflusste, jedoch zeigten Monolayerexperimente Hinweise auf eine mögliche Phosphorylierung der Linkerregion von Smad3. Auch die Kultivierung der MSC auf dem Sehnenscaffold und der Kollagenmatrix förderte die Wirkung von TGF-β3. Hierbei wurde eine Reduktion der Smad2-Linker-Phosphorylierung durch die Kultivierung auf Kollagenmatrizen, aber nicht durch ROCK-Inhibition festgestellt. Dementsprechend scheint die Scaffold-Wirkung entgegen der bisherigen Annahme nicht vollständig Rho/ROCK vermittelt zu sein. Dies wird durch die Ergebnisse, die keine gesteigerte ROCK-Aktivität auf der Kollagenmatrix nachwiesen, unterstützt. Darüber hinaus zeigte die Arbeit, dass humane und equine MSC ähnlich auf die kombinierte Behandlung mit TGF-β3 und Y 27632 reagieren, was auf eine konservierte Signaltransduktion hindeutet. Jedoch wiesen die Regulierungsmuster der Signalmoleküle TGF-β3 und Smad8 Unterschiede zwischen humanen und equinen MSC auf. Zusammengenommen können die Kultivierung auf Scaffolds und der Rho/ROCK-Signalweg den TGFβ3/Smad2/3-Signalweg beeinflussen, indem sie verschiedene Phosphorylierungsstellen der Smad-Linker-Region regulieren. Folglich scheint die Rho/ROCK-Inhibition eine
vielversprechende Strategie darzustellen, um die TGF-β3-induzierte tenogene Differenzierung von MSCs zu fördern.
uniforum 22 (2009) Nr. 4
(2009)
Wo Planung Gestalt annimmt:Beim Richtfest konnte sich die Öffentlichkeit ein Bild vom Innenleben des Gebäudekomplexes machen. Sechs Institute werden 2011 ins Biomedizinische Forschungszentrum Seltersberg einziehen.
*Wie die Uni tanzt: Eine perfekte Choreographie ließ das Sommerfest auf Schloss Rauischholzhausen zu einem Highlight werden. Für diejenigen, die erst nächstes Jahr dabei sein können, hier ein Rückblick in Bildern.
*Wenn eine Strategie aufgeht: Beim LOEWE-Programm kann die JLU einen Doppelerfolg für sich verbuchen: Bei der zweiten Staffel der hessischen Exzellenzinitiative erhielt sie den Zuschlag für ein Zentrum und einen Schwerpunkt.
*Wer neue Perspektiven sucht: Das ZMI hat Kooperationen mit chinesischen Partnern angestoßen. In seinem spannenden Reisebericht nimmt Prof. Henning Lobin die Leser mit in eine andere Welt.