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Neue Veröffentlichungen:
Analyse der Wirkung von microRNAs auf die Monozyten-Makrophagen Differenzierung am Beispiel von THP-1 Zellen
(2025) Aslantas, Özden
Die Erforschung von microRNAs verspricht in Zukunft bahnbrechende Ergebnisse in der Diagnose und Therapie von Erkrankungen zu liefern. Sie beteiligen sich auch an der Entstehung der Atherosklerose, welche den Grundpfeiler für kardiovaskuläre Erkrankungen bildet. Ein wesentlicher Schritt bei der Entstehung der Atherosklerose ist die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen. Die hier vorgelegte Studie untersucht die Expression ausgewählter microRNAs während der Monozyten- Makrophagen-Differenzierung.
Die Untersuchung erfolgte an THP-1 Zellen, einer monozytären Zelllinie. Unter Stimulation der Zellen mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (5ng /ml PMA) differenzierten diese zu Makrophagen, was schon mikroskopisch an einem veränderten Phänotyp mit Pseudopodien und polymorpher Erscheinungsform zu erkennen war. Auch die CD14- mRNA Expression, als Marker für die Makrophagendifferenzierung, zeigte eine signifikante Erhöhung nach 72-stündiger PMA-Stimulation. Unter dieser PMA- Stimulation wurden Expressionen verschiedener microRNAs analysiert. let-7f und miR- 92a wurden unter PMA-Gabe runterreguliert. Eine Hochregulation erfuhren miR-1, miR- 22 und miR-143. Die Expression von miR-21, miR-99a und miR-223 blieb unverändert. Die unter PMA-Gabe runterregulierten microRNAs, let-7f und miR-92a, zeigten nach Transfektion mit ihren jeweiligen AgomiRen einen Anstieg der Expression in den behandelten Zellen. AgomiR-let-7f steigerte die CD14-mRNA Expression, wohingegen der Einsatz von AgomiR-92a dazu führte, dass die CD14-mRNA Expression unter PMA reduziert wurde. Unter den AntagomiRen bewirkte lediglich AntagomiR-1 eine signifikante Erniedrigung der miR-1 Expression unter PMA. Unter diesen Bedingungen stieg die CD14-mRNA Expression. Die Makrophagendifferenzierung ist demnach bei niedriger miR-1 Expression verstärkt.
Schlussfolgernd kann man sagen, dass von den untersuchten microRNAs let-7f, miR-92a und miR-1 die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen unter PMA-Gabe beeinflussen. Verhindert man den Abfall von miR-92a, so wird die CD14-mRNA Expression und somit die Makrophagendifferenzierung reduziert. Dagegen bewirkt eine Reduktion von let-7f oder miR-1 eine erhöhte CD14-mRNA Expression, was auf eine verstärkte Differenzierung zu Makrophagen hinweist. Somit könnte eine Modulation der miR-1, miR-92a oder let-7f Expression therapeutisch genutzt werden, um atherosklerotische Vorgänge zu reduzieren.
Structural development and functional reconstitution in the olfactory system of the clawed frog Xenopus laevis
(2025) Kahl, Melina
The transition of tetrapods to terrestrial habitats is concomitant with the adaptation of the olfactory system (OS) to the environment. This is reflected at the anatomical and functional levels with the formation of different subsystems, including cell subpopulations that exhibit distinct protein expression at the molecular level. The expression patterns of specific proteins vary between different species, although the olfactory systems show general anatomical similarities. For instance, in fish the calcium-binding protein S100Z is expressed in different cell types in their olfactory epithelium, while in mammals it is associated with cells within the vomeronasal organ (VNO). In the course of my thesis, I analyzed the expression pattern of S100Z in the OS of the anuran Xenopus laevis. Using immunohistochemistry in whole mount and slice preparations I identified a subgroup of S100Z expressing olfactory receptor neurons (ORNs) in the larval main OS and in the middle cavity of adult Xenopus laevis. In larval animals, these ORNs showed a lateral distribution bias in the olfactory epithelium and exclusively projected into the intermediate and lateral glomerular cluster. In conclusion, S100Z expression in the OS of Xenopus laevis is exclusively associated with the main OS and not with the VNO.
Maintaining regenerative capacity is essential for the OS because of its exposed position to toxic substances or physical trauma. This capacity is attributed to the presence of two main cell types. Firstly, the basal cells of the olfactory epithelium, which are neuronal stem cells and support constant renewal by developing new supporting cells and ORNs. Secondly, the olfactory ensheathing cells (OECs), which enwrap the axons of ORNs until they project into the olfactory bulb (OB) in the forebrain. To date, the existence and role of OECs in the OS of Xenopus laevis have not been investigated in detail. I found vimentin expressing OECs enwrapping ORN axon bundles from the epithelium until the OB in larval Xenopus using immunohistochemistry. The presence of fibroblasts and macrophages in the olfactory nerve (ON) was determined through the utilization of immunohistochemistry and transgenic Xenopus lines. Unilateral ON transection induced a temporary transient and dynamic phosphorylation of the ribosomal protein S6 in these non-neuronal cells. In summary, I identified various cell types within the ON which protein expression is influenced by ON injury. The exact function of phosphorylated ribosomal protein S6 in the OS of Xenopus is still unknown.
Struktur-Funktions-Analyse der äußeren Netzhaut von Patienten mit biallelischen Sequenzvariationen im RPE65 Gen mittels Spectral Domain Optischer Kohärenztomographie
(2025) Tanrikulu, Özgün
Biallelische Sequenzvariationen im RPE65 Gen stellen sich phänotypisch variabel als Lebersche Congenitale Amaurosis (LCA), Early Onset Severe Retinal Degeneration (EOSRD) oder Retinitis Pigmentosa (RP) dar und sind mit frühen funktionellen und strukturellen Veränderungen der Netzhaut assoziiert. Diese manifestieren sich unter anderem mit einem reduzierten Visus und einer Schichtdickenreduktion der äußeren Retina. Das Ziel dieser Studie war eine Feinanalyse und Charakterisierung der Veränderungen in der zentralen Retina vom Retinalen Pigmentepithel (RPE) bis zur Externen Limitierenden Membran (ELM) mittels A-Scan Analyse des Spectral Domain- Optischen Kohärenztomographen (SD-OCT) bei Patienten mit genetisch gesicherten biallelischen Sequenzvariationen im RPE65 Gen (RPE65-Inherited Retinal Dystrophies/RPE65-IRDs) im Vergleich zu einer gesunden Kontrollprobandengruppe sowie eine Struktur-Funktions-Analyse des fovealen Zentrums und des Visus. Ferner wurden die interokulär funktionelle Symmetrie des BCVA und die strukturelle Symmetrie der Schichten im fovealen Zentrum der Patientenaugen untersucht.
SD-OCT-B-Scans von 21 Augen von 11 Patienten mit RPE65-IRDs wurden anhand von Qualitätskriterien und einer zumindest partiellen Abgrenzbarkeit der Ellipsoid Zone (EZ) ausgewählt und analysiert. Die SD-OCT-A-Scans wurden im fovealen Zentrum und an definierten Messpunkten in Abständen von 250-500 μm bis zu 3000 μm nach nasal und temporal zum fovealen Zentrum untersucht. Die im Hinblick auf das Lebensalter angeglichene gesunde Kontrollprobandengruppe bestand aus 10 Probanden. Die Abstände der Peaks der hyperreflektiven Banden der äußeren retinalen Schichten wurden vom RPE zur ELM, vom RPE zur EZ und von der EZ zur ELM jeweils mit einer hausintern entwickelten MATLAB Software in vertikaler Achse bestimmt. Der jeweilige bestkorrigierte Visus (BCVA) zum Untersuchungszeitpunkt wurde der Patientenakte entnommen.
Bei einem jungen Patientenkollektiv [Altersspannweite 4-23 Jahre, Altersmedian 7 Jahre] mit mindestens partiell erhaltenen Schichten der äußeren Retina bestätigte diese Studie vorangegangene strukturelle Erkenntnisse, wie die eines frühen Verlusts der EZ- und ELM-Schicht und eine Reduktion der äußeren Retina. Auch die vorbekannte hohe funktionelle interokuläre Symmetrie der Abnahme des BCVA konnte für die Gesamtgruppe der Patienten bestätigt werden. Bei Betrachtung der Ellipsoid Zone Width (EZW) als Landmarke der retinalen Degeneration wurde als neue Erkenntnis hinzugewonnen, dass Patientenaugen mit regelrechter EZW im B-Scan eine ebenfalls hohe interokuläre Symmetrie des BCVA gezeigt haben, wohingegen bei Schädigung der EZW im B-Scan eine Abnahme der interokulären BCVA Symmetrie nachweisbar war. Wie vorangegangene Studien war bei hoher Streuung der Werte kein linearer oder anderer Zusammenhang zwischen der Reduktion der äußeren Retina im fovealen Zentrum und des BCVA abgrenzbar. Bei Unterteilung der Zapfen im fovealen Zentrum in die Subschichten RPE-EZ als Schicht der Außensegmente und der äußeren Innensegmente sowie der EZ-ELM als Schicht der inneren Innensegmente ließ sich als weiterführende neue Subanalyse jeweils kein linearer Zusammenhang dieser Schichten und des BCVA feststellen.
Während als weitere neue Erkenntnis bei regelrechter Abgrenzbarkeit der hyperreflektiven Schichten der äußeren Retina und einem BCVA ≤0.1 logMAR die RPE-ELM Schicht und die RPE-EZ Schicht im fovealen Zentrum eine interokuläre Symmetrie zeigten, ließ die EZ-ELM Schicht keine interokuläre Symmetrie erkennen. Letztere könnte auf eine frühe, ungleichförmig interokuläre Degeneration der Innensegmente der M- und L-Zapfen im fovealen Zentrum schließen lassen. Unter Nutzung der Kennzonen der Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) konnte als weitere neue Erkenntnis bei Patientenaugen mit einem BCVA ≤0.1 logMAR für die RPE-ELM und RPE-EZ Schichten ein erhaltenes physiologisch glockenförmiges Muster von der temporären und nasalen Makulakennzone zum fovealen Zentrum beobachtet werden, während dieses physiologische Muster von der peripheren zur makulären Kennzone bereits bei diesen Patientenaugen aufgehoben war. Da bei der gleichen Patientenaugengruppe dieses physiologische Muster für die EZ-ELM Schicht in sämtlichen ETDRS Kennzonen nicht nachweisbar war, könnte dies einen Indikator einer frühen Degeneration der Photorezeptorinnensegmente darstellen. Bei den Patientenaugengruppen mit einem BCVA >0.1 logMAR konnten sowohl für die RPE- ELM Schicht wie auch für die Subschichten RPE-EZ und EZ-ELM eine Aufhebung des glockenförmigen Verdickungsmusters abgegrenzt werden, sodass eine ungerichtete und homogene Reduktion, respektive Degeneration, in der zentralen Retina nachweisbar war. Die Gruppe mit einem BCVA >0.1 - 0.49 logMAR und ohne Sehschwäche zeigte dabei ein identisches Degenerationsmuster wie die Gruppe mit einem BCVA >0.49 logMAR und Sehschwäche nach WHO-Kriterien.
Mittels SD-OCT-A-Scan Analyse der äußeren Schichten in der zentralen Retina kann durch Peak-zu-Peak-Messung der hyperreflektiven Schichten eine unkomplizierte Degenerationsevaluation bei Patienten mit biallelischer Sequenzvariation im RPE65 Gen im Verlauf bzw. zur Evaluation möglicher gentherapeutischer Effekte in den postinterventionellen Kontrollen sowie im postinterventionellen Langzeitkontrollverlauf vorgenommen werden. Bei bereits nachgewiesener Zapfendegeneration bei jungen Patienten mit sehr gutem BCVA regen diese Ergebnisse ferner eine Diskussion zur frühen Indikationsstellung der subretinalen Gentherapie an.
Die Bedeutung humaner Papillomviren in der Kopf-Hals-Onkologie
(2024) Wagner, Steffen
Trotz des allgemeinen sinkenden Konsums von Tabak bleibt die Inzidenz von Kopf-Hals-Karzinomen (KHK) in Deutschland und anderen Ländern weitgehend konstant. Dies geht auf eine signifikante Zunahme HPV-assoziierter Karzinome zurück, was inzwischen als Risikofaktor bei Plattenepithelkarzinomen des Oropharynx (OPSCC) anerkannt ist. Unsere, sowie weitere Arbeiten der letzten Jahre zeigen, dass HPV-assoziierte OPSCC eine eigenständige Tumorentität sind und sich grundlegend von Noxen-assoziierten KHK unterscheiden. Virale Onkoproteine wie E6 und E7 sind neben der charakteristischen Überexpression des zellulären p16INK4a an einer Reihe molekularer Veränderungen beteiligt, die in HPV-negativen OPSCC durch genetische Veränderungen ausgelöst werden. Hierzu gehören insbesondere immun-escape Mechanismen, wie die Reduktion der HLA Klasse I Expression oder die Induktion hemmender Liganden (z.B. PD-L1) von Immun-Checkpoint Signalwegen. Dennoch sind HPV assoziierte OPSCC durch eine Präsenz von Immunzellen (wie NK-Zellen) charakterisiert. Viele dieser HPV-bedingten Veränderungen können diagnostisch und therapeutisch bedeutsam sein. So kann virale DNA im Blut von Tumorpatienten (liquid biopsy) nachgewiesen und mit dem Verlauf der Erkrankung korreliert werden. Angesichts der Bedeutung von HPV in der Kopf-Hals-Onkologie und des spezifischen Mechanismus der Karzinogenese, mit vergleichsweise homogenen Veränderungen und meist milderen klinischen Verläufen, erscheinen HPV assoziierte OPSCC besonders geeignet für neue immunologische Therapiekonzepte.
Analyse der DNA-Reparaturmechanismen nach therapeutischer Genomeditierung mittels induzierbarer Cas9 Endonuklease in vitro
(2025) Türk, Franziska Maria
Erblich bedingte Netzhauterkrankungen betreffen viele Menschen und sind häufig verantwortlich für den Verlust der Sehkraft. Begründet liegen sie meist in einer Mutation eines relevanten Gens. Es existieren unterschiedliche therapeutische Optionen, die abhängig von dem Wissen um die Ursache und dem Fortschritt der Erkrankung zum Einsatz kommen. Therapeutische Genomeditierung, das damit einhergehende Einbringen eines DSBs sowie die nachfolgenden zelleigenen Reparaturmechanismen stellen eine wichtige Rolle im Bereich der Gentherapie dar.
Ziel dieser Arbeit war es, das BRET-Reportersystem in Verbindung mit einer induzierbaren Cas-Variante zu testen und mehr Informationen über das neuronenspezifische Verhalten nach einem induzierten DSB zu generieren.
Nachdem die Funktionalität des bereits in der Arbeitsgruppe entwickelten BRET-Systems mit den entsprechenden gRNA/Cas9-Komplexen bestätigt wurde, folgte die Herstellung eines induzierbaren Cas9-Systems passend zu den Targetsequenzen der BRET-Reporter, welche in HEK293-T-Zellen transfiziert und auf ihre Funktionalität hin überprüft wurden. Im letzten Schritt der Arbeit wurde versucht, das Cas9-System mit gRNA und BRET-Reporten mittels Cotransfektion in die iNGNs zu integrieren.
In Zukunft kann die Kombination der gRNA/iCas mit anderen Reportersystemen zu weiteren Informationen über das zellspezifische Reparaturverhalten nach einem DSB führen. Hier sollte jedoch zunächst die Erhöhung der Transfektionseffizienz der iNGNs im Fokus stehen und durch Änderung der Transfektionsmethode, der DNA-Bereitstellung und/oder des Promotors gesteigert werden.
Kurzfristiges Ziel ist es, die iNGNs als intermediäres System mit gRNA/iCas-Systemen zu etablieren, um neuronenspezifische Informationen im Bereich der DNA-Reparaturforschung in Bezug auf erblich bedingte Netzhauterkrankungen generieren zu können. Langfristig steht die Ermöglichung einer direkten Therapie von erblich bedingten Erkrankungen mittels Genome Editing im Zentrum des Bestrebens.
Zukünftig könnten CRISPR/(i)Cas und iPSCs somit einen wesentlichen Beitrag zu einer patientenspezifischen, regenerativen Medizin leisten.