Einfluss elektrischer Felder auf Struktur und Funktion von Trypsin

Abstract

In unserer heutigen Gesellschaft kommt es vermehrt zur Einwirkung artifizieller elektromagnetischer Felder auf Lebewesen. Inzwischenwerden diesen auch vermehrt negative Einflüsse auf den Organismus zugeschrieben. Besonders diskutiert werden in diesemZusammenhang hochfrequente elektromagnetische Felder. Über die Wirkung von Feldern auf Biomoleküle (z.B. Proteine) imNiedrigfrequenzbereich gibt es nicht sehr viele Studien, insbesondere nicht an in vitro-Systemen. Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, mögliche Einflüsse eines elektrischen Feldes mit niedrigen Frequenzen auf ein geeignetes invitro-System zu untersuchen, wobei hier der Einfluß auf Proteine und ihre Funktion im Vordergrund stand. Ein geeignetes Enzym für die Untersuchung fand sich in der Protease Trypsin. Als Marker für den Einfluß des elektrischen Feldes auf dasEnzym sollte die Enzymaktivität gegenüber einem geeigneten Substrat dienen. Dazu wurden mehrere Substrate in bezug auf denSubstratumsatz durch Trypsin getestet. Für die Bestimmung der spezifischen Aktivität wurden außerdem ihre molarenExtinktionskoeffizienten bestimmt. Das Substrat BAPA erschien dabei als das geeignetste Substrat für Trypsin, so daß hier noch zusätzlichder Km-Wert von Trypsin für dieses Substrat ermittelt wurde, um einen Hinweis für die zu verwendende Substratkonzentration zu erhalten. Das Trypsin konnte durch die Bindung an eine Matrix im elektrischen Feld stabilisiert werden. Als Matrix wurde silanisiertes Kieselgelverwendet, an welches das Trypsin über einen Anker aus Glutardialdehyd an die Matrix gebunden werden konnte. Dabei wurden die füreine Immobilisierung des Enzyms geeigneten Inkubationszeiten und die anschließend gebundene Menge an Enzym bestimmt. Außerdemwurden die Aktivität dieses immobilisierten Trypsins und die Abhängigkeit seiner Aktivität von pH-Wert und Temperatur untersucht. Eszeigte sich, daß die Aktivität des immobilisierten Trypsins nur noch ca. 30-40 % derjenigen des löslichen Trypsins besaß. Im alkalischenpH-Bereich ergab sich für das immobilisierte Trypsin eine erhöhte Stabilität gegenüber dem löslichen. Für den Temperaturbereichzwischen 25 °C und 30 °C ergibt sich ein linearer Zusammenhang zwischen Temperatur und Enzymaktivität, allerdings keine erhöhteStabilität des immobilisierten gegenüber dem löslichen Trypsin. Als der für die Funktion des Trypsins relevante Parameter wurde seine Enzymaktivität bestimmt. Da die Matrix optisch nicht durchlässigwar, wurde ein Durchflußsystem entwickelt, bei dem die Substratlösung kontinuierlich am Enzym vorbeigeleitet und der Substratumsatzdanach photometrisch gemessen werden konnte. Um verschiedene strukturelle Zustände des Trypsins im elektrischen Feld untersuchen zu können, wurden der Substratlösungdenaturierende bzw. strukturbeeinflussende Reagentien zugefügt. Für die teilweise Lösung von Wasserstoffbrücken wurde Harnstoffverwendet. Dabei zeigte sich, daß das immobilisierte Enzym nicht stabiler gegenüber Harnstoff war als das lösliche. Allerdings war einefast vollständige Renaturierung möglich. Eine ergänzende Störung der ionischen Wechselwirkungen im Enzym wurde durch die zusätzlicheZugabe von Salz in die Lösung erreicht. Für die Untersuchung des Einflusses von elektrischen Feldern auf das immobilisierte Trypsin wurden zwei Spannungsquellen verwendet,wobei es mit der einen möglich war, bei fester Netzfrequenz die Feldstärke zu verändern, mit der anderen die Frequenz mit einer davonabhängigen konstanten Feldstärke. Die Änderung der Absorption bei der photometrischen Enzymaktivitätsmessung wurde als Parameterfür einen Einfluß des Feldes verwendet. Dabei ergaben sich die meisten positiven Effekte bei den höchsten eingesetzten Feldstärken.Auch zeigte sich ein Einfluß des strukturellen Zustandes des Enzyms auf die Höhe des Effektes. Über eine mögliche Abhängigkeit desEffektes von der Frequenz ließen sich bei den Untersuchungen keine Aussagen treffen. Für die Erklärung des Einflusses durch einelektrisches Feld auf das Enzymmolekül wurden theoretische Überlegungen durchgeführt und mit den praktischen Ergebnissen verglichen.