Reduced Graphene Oxide Biosensors for Prostate Cancer Biomarker Detection

Abstract

Prostate cancer (PCa) is a major mortality cause for men around the world and therefore there is a high demand for reliable diagnostic solutions. Prostate-specific antigen (PSA) is currently the representative biomarker for pre-screening of PCa, necessarily followed by biopsy examinations for confirmatory diagnosis. In the biomedical market, equipment to detect PSA in its relevant clinical concentration is already commercialized. These devices are accurate, but the bench-top systems are bulky, expensive, have a long response time, and rely on optical labels. To eliminate these drawbacks, point-of-care (POC) devices are under development, aiming at cost-effective, precise, portable, disposable and environmentally friendly designs with a fast response time. Most of the devices are utilizing conventional biosensing principles. However, the miniaturization of these approaches directly induces performance variations and a drastic decrease of the sensing accuracy. It is noteworthy that no biomarker is ideal, and no definite diagnostic decision can be based on a single biomarker. Thus, the detection of a combination of various biomarkers is recommended to provide multi-variable information for accurate diagnosis in the early stage of cancer development. Some biomarkers are more specific for PCa than others, but of a relatively low concentration in the clinical samples.Therefore, new biosensing concepts with multiplexing capability are under intensive investigation.Graphene, as an atomic carbon lattice, possesses superior electronic, optical and plasmonic properties, which trigger a revolution in the microelectronics field. Graphene is of atomic thickness but mechanically ultra-strong, and the carrier transport is ballistic in the condition of high charge carrier concentrations. In addition, this material is highly heat resistant, cheap, environmentally friendly and biocompatible.The aim of this thesis is to utilize graphene-based material for novel biosensors towards PSA detection. Graphene oxide (GO) and reduced graphene oxide (rGO), as derivatives of graphene, partially possess the promising properties of graphene. In addition, they provide diverse functionalization possibilities for immobilization of biomolecules and a wafer-scale preparation capability on arbitrary substrates. In the framework of this thesis, GO flakes were chemically exfoliated by a newly developed low-temperature exfoliation and desalination (LTEDS) method. The high-quality GO flakes were characterized intensively using scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscope (TEM), ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, X-ray diffraction (XRD) and Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy. The graphene oxide and reduced graphene oxide ((r)GO) thin films were prepared in wafer-scale using the techniques of gas-phase silanization, spin-coating, followed with patterning by photolithography and reactive ion etching. After a thermal reduction, electronic characterizations of rGO thin films were carried out using cyclic-voltammetry, current-voltage (I-V) characterizations and lectrolyte-sensitive field-effect transistor (ESFET) measurements. These combined electronic and electrochemical characterizations aimed at analyzing the wafer-scale topographical completeness, uniformity, and field-effect mobility of the rGO thin films.The rGO thin films were utilized as functional layers in different biosensor device configurations of surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy, electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and ESFET. The biosensing performances and the corresponding sensing mechanisms were analyzed and evaluated in detail. The bipolar property of the rGO thin films allowed a tuning effect of the SPR intensity. Concanavalin A (ConA) was detected using the rGO based SPR principle and a limit of detection (LOD) as low as 0.01 µg/ml was achieved. Such a LOD was not attainable by the standard gold SPR chips. Besides, the electronic biosensing experiments were all carried out in a buffer solution with an ionic strength of 162 mM and a corresponding short Debye-screening length (0.76 nm), which were similar to physiological solutions (150 mM and 0.78 nm). The rGO based EIS and ESFET sensors exhibited the outstanding biosensing capability to detect PSA in its relevant clinical concentration range (4-10 ng/ml).The rGO based biosensors as developed and optimized in this thesis work showed a highly sensitive PSA detection beyond the Debye-screening limitation and demonstrated a great potential towards real biosensor applications for future healthcare. Prostatakrebs (PCa) ist weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität bei Männern. Daher besteht ein hoher Bedarf an zuverlässigen diagnostischen Verfahren. Prostataspezifisches Antigen (PSA) ist derzeit der repräsentative Biomarker für die PCa-Voruntersuchung, dem bei Auffälligkeiten für eine sichere Diagnose weitere Biopsieuntersuchungen folgen. Auf dem biomedizinischen Markt sind bereits Geräte zum Nachweis von PSA in klinisch relevanten Konzentrationen kommerziell erhältlich. Diese Systeme sind präzise, jedoch sind sie groß, teuer, haben eine lange Analysezeit und beruhen auf optischen Markern zur Detektion der Biomoleküle. Aktuell werden Point-of-Care (POC) Geräte entwickelt, die kostengünstig, präzise, tragbar und umweltfreundlich sind und dennoch eine schnelle Analysezeit besitzen. Die meisten dieser Geräte verwenden herkömmliche Biosensor-Prinzipien. Die Miniaturisierung der klassischen Prinzipien führt jedoch zu Ungenauigkeiten, die mit einer drastischen Verringerung der Zuverlässigkeit einhergehen. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, dass kein Biomarker ideal ist und keine definitive diagnostische Entscheidung auf einem einzigen Biomarker basieren kann. Daher werden Anstrengungen unternommen, Kombinationen verschiedener Biomarker nachweisen zu können, um schon im Frühstadium der Krebsentwicklung multivariante Informationen für eine genauere Diagnose bereitzustellen. Dabei sind einige der neuen Biomarker spezifischer für PCa als andere, jedoch liegen sie alle nur in relativ geringen Konzentrationen in den klinischen Proben vor. Aus diesem Grund werden aktuell neue Biosensorkonzepte mit der Fähigkeit zur parallelen Detektion mehrerer Biomarker entwickelt.Graphen besitzt als atomares Kohlenstoffgitter herausragende elektronische, optische und plasmonische Eigenschaften, die aktuell eine Revolution in der Mikroelektronik auslösen. Graphen ist nur eine Atomlage dick, jedoch mechanisch ultrastark und der Ladungsträgertransport ist bei hohen Ladungsträgerkonzentrationen ballistisch. Außerdem ist dieses Material sehr hitzebeständig, billig, umweltfreundlich und biokompatibel.Das Ziel dieser Arbeit ist die Verwendung von graphenbasiertem Material in neuartigen Biosensorkonzepten für den PSA-Nachweis. Graphenoxid (GO) und reduziertes Graphenoxid (rGO), als Derivate von Graphen, besitzen zum Teil auch diese vielversprechenden Materialeigenschaften. Darüber hinaus bieten die funktionellen Gruppen im GO Material vielfältige Möglichkeiten für die Immobilisierung von Biomolekülen und erlauben zudem eine Wafer-skalige Herstellung von Sensoren auf beliebigen Substraten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden GO-Flocken durch eine neu entwickelte Methode zur Niedertemperatur-Exfoliation von Graphit mit nachfolgender Entsalzung (LTEDS) hergestellt. Die qualitativ hochwertigen GO-Flocken wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), UV-VIS-Spektroskopie, Röntgenbeugung (XRD) und Fourier-Transform-Infrarot (FT-IR) Spektroskopie intensiv charakterisiert. Die GO- und rGO-Dünnschichten wurden im Wafer-Maßstab unter Verwendung einer Gasphasen-Silanisierung der Wafer und Spin-Coating dünner Schichten hergestellt und mittels Photolithographie und reaktivem Ionenätzen strukturiert. Nach der thermischen Reduktion in leitfähige rGO-Dünnfilme und Strukturen wurden elektrische Charakterisierungen mittels zyklischer Voltammetrie, Strom-Spannungs (I-V)-Kennlinien und electrolytensensitiven Feldeffekt-Transistor (ESFET) Messungen durchgeführt. Diese kombinierten elektronischen und elektrochemischen Charakterisierungen zielten darauf ab, die topographische Qualität, Gleichmäßigkeit und Ladungsträgerbeweglichkeit der rGO-Dünnfilme im Wafermaßstab zu analysieren.Die rGO-Dünnfilme wurden als funktionelle Schichten in verschiedenen Biosensorkonzepte wie Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR), elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) und ESFET-Messungen verwendet. Die Eigenschaften dieser Biosensorkonzepte und die entsprechenden Sensormechanismen wurden analysiert und detailliert ausgewertet. Der bipolare Ladungsträgertransport innerhalb der rGO-Dünnfilme ermöglichte ein elektrisches Abstimmen der SPR-Intensität. Concanavalin A (ConA) wurde unter Verwendung des rGO-basierten SPR-Prinzips nachgewiesen, und eine Nachweisgrenze (LOD) von nur 0.01 µg/ml wurde erreicht. Solch eine niedrige LOD war mit Gold-basierten SPR-Sensoren nicht erreichbar. Außerdem wurden alle elektronischen Biosensor Experimente in einer Pufferlösung mit einer Ionenstärke von 162 mM und einer daraus resultierenden, sehr kurzen Debye Abschirmungslänge (0.76 nm) durchgeführt, die einer physiologischen Lösung sehr ähnlich war (150 mM und 0.78 nm). Die rGO-basierten EIS- und ESFET-Sensoren zeigten dabei eine hervorragende Performance, um PSA im klinisch relevanten Konzentrationsbereich (4-10 ng/ml) nachzuweisen.Die in dieser Dissertation entwickelten und optimierten, rGO-basierten Biosensoren leisteten einen hochsensitiven PSA-Nachweis jenseits der typischen Limitierung durch die Debye-Abschirmung von Ladungen und zeigten dadurch ein sehr großes Potenzial für reale Biosensorkonzepte für die Gesundheitsversorgung der Zukunft.