Entwicklungen von PCR-Methoden zur sensitiven Quantifizierung des mit der chronisch myeloischen Leukämie assoziierten BCR/ABL-Fusionstranskriptes

Abstract

Die chronisch myeloische Leukämie (CML) ist die häufigste myeloproliferative Erkrankung und stellt pathophysiologisch die erstehämatologische Erkrankung dar, bei der eine charakteristische Chromosomenaberration, das sogenannte Philadelphia-Chromosom(Ph+), beschrieben wurde. Dieses Chromosom stellt das Produkt einer reziproken Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22(t(9;22)(q34;q11)) dar. In 98 % der Ph+-positiven Fälle führt diese Translokation auf dem Philadelphia-Chromosom zur Bildung einespathophysiologisch relevanten Fusionsgens, des BCR/ABL-Gens. Es gilt als gesichert, daß die Bildung des BCR/ABL-Gens inhämatopoetischen Stammzellen ein wesentlicher Schritt in der Veränderung des Wachstums- und Regulationsverhaltens der Stammzelleist, die zum charakteristischen hämatologischen und klinischen Bild der CML führt. Daher stellt das Philadelphia-Chromosom für die CMLein wichtiges diagnostisches und prognostisches Kriterium dar. Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zur Detektion und Quantifizierung des Transkriptes des BCR/ABL-Fusionsgens zu entwickeln, diesich für die Routineanlytik eignet und einen möglichst sensitiven Nachweis erlaubt. Unter diesen Voraussetzungen boten sich prinzipiell nurMethoden an, die auf der Polymerase-Kettenreaktion basieren. Da die Bruchpunkte, die zur Translokation führen, über einen weitenBereich gestreut vorkommen, war es sinnvoll, die Quantifizierung des BCR/ABL-Fusionsgens über dessen Transkript zu führen und somiteine quantitative RT-PCR zu etablieren. Die Quantifizierung wurde zunächst über eine quantitative kompetitive RT-PCR durchgeführt. ZurGenerierung eines internen Standards, der mit der gleichen Effizienz amplifiziert wird wie die Wildtyp-Sequenz wurde ein Plasmid mitintegriertem BCR/ABL-cDNA-Fragment generiert, welches sich in einer singulären Restriktionsschnittstelle von derBCR/ABL-Wildtyp-Sequenz unterscheidet. Von diesem Plasmid wurde ein definiertes in-vitro-Transkripte synthetisiert und isoliert. ImAnschluß daran durchgeführte Titrationsexperimente bestätigten, daß es sich bei dem gewählten Standard um einen idealen Standardhandelt, der mit der gleichen Effizienz wie die Wildtyp-Sequenz amplifiziert wird. Neben der Quantifizierung der RT-PCR-Produkte nachspezifischer Restriktionsspaltung mittels densitometrischer Gelbildanalyse wird hier eine neue Quantifizierungsmethode mittelskapillar-elektrophoretischer Auftrennung und LIF-Detektion der Fluorophor-markierten Spaltfragmente beschrieben. sie ist aber durcheinfachere Handhabung und automatische Prozessierung der Proben und automatische Analyse der gewonnenen Daten besser für dieDurchführung einer Routineanalyse geeignet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, auf real-time-Detektion basierende RT-PCR-Methode zur Quantifizierung desBCR/ABL-Transkriptes entwickelt. Diese Methode basiert auf einer online-Fluoreszenzdetektion während der PCR. In dieser Arbeit wurdeeine Ein-Schritt real-time RT-PCR entwickelt, die in der Lage ist, eine Leukämiezelle in 105 gesunden Zellen nachzuweisen und zudemeine genaue Quantifizierung bis hinunter zu 100 Transkriptkopien erlaubt. Weiterhin erlaubt sie erstmals Quantifizierungen über einenlinearen Meßbereich von 6 Größenordnungen. Durch Verwendung von BCR/ABL-spezifischen HybProbes entfällt aufgrund der hohenSpezifität der Sonden eine weitere Analyse der Proben. Um mögliche Qualitätsunterschiede der Patienten-RNA auszugleichen, wurdezudem ein Primer/Sonden-System für das Transkript des housekeeping-Gens PBGD etabliert und die Methode durch Analyse vonCML-Patienten-Proben verifiziert.