Struktureinflüsse auf das Fragmentierungs-Verhalten von Peptiden bei PSD-MALDI Massenspektrometrie

Abstract

Durch das zunehmende Interesse an der Strukturaufklärung von Biopolymeren in der biologischen und biomedizinischen Forschung habenmassenspektrometrische Verfahren, wie Matrix-Assisted-Laser Desorption/Ionization (MALDI) und Elektrospray-Ionisations (ESI)Massenspektrometrie, in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen. Die Masse eines Biomoleküls, wie zum Beispiel vonProteinen, Peptiden, Oligosacchariden oder Oligonucleotiden, ist ein aus der Struktur leicht zu ermittelnder, charakteristischer Parameter,der sich mit einem Massenspektrometer auch bei geringsten Probenmengen (fmol) noch äußerst präzise (Fehler < 10 ppm) bestimmenläßt. In komplexen Gemischen, wie dem Verdau eines Proteins, liegen zahlreiche Komponenten vor, die sich bei der massenspektrometrischenAnalyse teilweise gegenseitig unterdrücken, so daß nur ein Teil der tatsächlichen Bestandteile nachgewiesen werden kann. Darüberhinaus gibt es häufig Interferenzen von Molekülen gleicher Masse oder den Isotopenmustern der Moleküle ähnlicher Masse, wodurch dieSpektren weiter verkompliziert werden und die Interpretation Fehler aufweisen kann. Daher wurde in dieser Arbeit den Isotopenmustern von Peptiden große Aufmerksamkeit geschenkt. Es wurde ein analytisches Verfahrenentwickelt, mit dessen Hilfe die Isotopenmuster, trotz Masseninterferenzen, aus einem MALDI-Massenspektrum heraus gefiltert werden, sodaß bei einer anschließenden Peak-Identifikation die Fehlinterpretationen deutlich reduziert werden. Darüber hinaus stellte sich heraus,daß eine Erweiterung der Methode auf ESI-Massenspektren, bei denen mehrfache Ladungen pro Peptid berücksichtigt werden müssen,wertvolle zusätzliche Informationen liefert. Die Unterdrückung von Signalen kann allerdings nicht durch eine nachgeschaltete Datenverarbeitung, wie es die Filterung darstellt,vermieden werden, sondern es muss eine Verbesserung der experimentellen 'Rohdaten' erfolgen. Ein Ansatz ist eine Optimierung derPräparation durch Fraktionierung der Bestandteile der Ausgangsprobe und getrennte massenspektrometrische Analyse. Läßt sich dieProbe nicht fraktionieren, kann die Empfindlichkeit gesteigert werden, indem die stabilen Peptid-Ionen gezielt selektiert werden. Hierfürwird eine experimentelle Methode beschrieben. Der Hauptteil der Arbeit gliedert sich in vier Teile. Im ersten Abschnitt werden die Einflüsse der experimentellen Bedingungen auf diequantitativen Ergebnisse (Signalintensitäten) untersucht. Der folgende Teil behandelt die Grundlagen zur Beschreibung der Isotopenmustervon Peptiden. Unter anderem wird hier eine Methode zur Abschätzung des Schwefelgehaltes vorgestellt. Aus diesen Erkenntnissen wird imnächsten Abschnitt ein Filteralgorithmus entwickelt und auf MALDI- und ESI-Massenspektren angewendet. Die experimentelleVerbesserung der 'Rohdaten' der Massenspektren durch einen Vorläufer-Ionen-Scan wird im letzten Abschnitt beschrieben. Hierbeihandelt es sich gleichzeitig um ein weiteres Anwendungsbeispiel für den Filteralgorithmus, da die Peptide mit Hilfe der fortgeschrittenenPeak-Identifikation aufgelistet werden.