Entwicklung einer einfachen, empfindlichen und schnellen Methode zur Immundiagnose der Bilharziose (Schistosomiase)

Abstract

Die Bilharziose, auch Schistosomiase genannt, ist in vielen tropischen und subtropischen Regionen der Welt nach der Malaria diezweitwichtigste Parasitenerkrankung. Die Krankheit wird durch verschiedene Trematoden der Gattung Schistosoma ausgelöst. Da wederzur Zeit noch in naher Zukunft ein ausreichend wirksamer Impfstoff zur Verfügung stehen wird, müssen sich Programme zur Bekämpfungder Schistosomiase auf die Diagnose und die medikamentöse Behandlung der betroffenen Bevölkerung konzentrieren. Ziel dieser Arbeit war es, ein Diagnoseverfahren zu entwickeln, welches empfindlich genug ist, auch mittlere und leichte Infektionennachzuweisen. Nach Möglichkeit sollte auch versucht werden, zwischen den in Afrika gemeinsam auftretenden Erreger-Arten Schistosomamansoni und Schistosoma haematobium zu diskriminieren. Dies sollte mit Hilfe speziesspezifischer rekombinanter Antigene erreichtwerden. Aus cDNA-Banken von adulten S. mansoni-Würmern und Eiern von S. japonicum wurden mit pools von Patientenseren zahlreicheimmunreaktive Klone isoliert und charakterisiert. Dazu wurden die Phagenklone durch PCR-Analyse, Sequenzanalyse und Expression derGenprodukte als rekombinante Proteine in größerem Maßstab in reiner Form dargestellt. Um ihre Brauchbarkeit für die Immundiagnose zutesten, wurden die rekombinanten Antigene in einem Westernblot-ähnlichen Verfahren mit größeren Zahlen von Patientenseren undKontrollseren untersucht. Als wichtigstes Ergebnis wurde dabei ein neues Antigen, Sj22, entdeckt, das nicht nur zu einer deutlichenSteigerung der Empfindlichkeit des Nachweises aller wichtigen Schistosomenarten führt, sondern insbesondere auch die Diagnose derasiatischen Form der Krankheit, für die es noch kein ausreichend empfindliches Nachweisverfahren gibt, zuläßt. Die angestrebteDiskriminierung der beiden afrikanischen Arten der Erreger gelang leider nicht. Durch die Kombination des neuen Antigens Sj22 mit zwei weiteren schon bekannten diagnostischen Antigenen konnte einNachweisverfahren für die Krankheit etabliert werden, das im Unterschied zu anderen Diagnoseverfahren eine extrem niedrigeNachweisgrenze bezüglich der Krankheitserreger hat Es eignet sich daher insbesondere für solche Länder, die durchBekämpfungsmaßnahmen die Bilharziose weitgehend reduziert haben oder gefährdet sind, die Seuche einzuschleppen. Da die Diagnose im Feld unter einfachsten Bedingungen erfolgen muß, wurde versucht, die Technik möglichst einfach und sicher zugestalten. Es wurde mit Erfolg getestet, daß Vollblut statt Patientenserum verwendet werden kann und daß die geringe Menge benötigtenBlutes auf Filterpapier eingetrocknet werden kann. Da hierfür keine Kanülen benötigt wären, wird dadurch das Infektionsrisiko sowohl fürdas medizinische Personal als auch für die betroffene Bevölkerung beträchtlich herabgesetzt. Schließlich gelang es auch noch, das Testverfahren erheblich zu beschleunigen. Durch ein neu entwickeltes Verfahren zur Konjugation vonProteinA an ein Kohlenstoffkolloid und dessen Verwendung zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Komplexen kann der Immuntest mitderselben Empfindlichkeit jetzt innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden. Bilharzia, also known as schistosomiasis, is in many tropical and sub-tropical regions of the world the second common parasite diseaseafter malaria. The disease is caused by different species of the trematode Schistosoma. Because neither at present nor in the near futurean effective vaccine will be availabe, control programs have to concentrate on the diagnosis and medical treatment of the concernedpopulation. Aim of this work was to develp an immunodiagnostic method which is sensitive enough to identify medium or light infections. As anadditional approach, it has also been tryed to find a possibility to distinguish between the two african parasite species, Schistosomamansoni and Schistosoma haematobium. With cDNA-libraries of adult S. mansoni worms and eggs of S. japonicum at the one hand, and pools from patient sera at the other hand, anumber of immune reactive clones were isolated and characterized. The purity of the isolated phage clones was checked by PCR,sequence analysis and expression of the corresponding gene product as a recombinant protein. To test the use for immunodiagnosis, therecombinant antigenes were analysed in the so-called 'line blot', a westernblot-like procedure, with a bigger number of patient and controllsera. As a most important result, the new diagnostic antigen Sj22 was detected. It led to a marked increase of the sensitivity of theimmunological test of the most important schistosoma species and it also helps to analyse the Asian typ of the disease, caused by S.japonicum, for which there is no suitably sensitive diagnosis available yet. The approach to distinguish between the two African species ofthis germ was unfortunately not successful. By the combination of the new antigene Sj22 and two other diagostic antigenes, a very sensitive detection method for the disease could beestablished. This method, compared to other diagnosticprocedures, detects extremely low numbers of the parasite in the blood of thepatients. This new diagnostic technique is most helpful in those countries where schistosomiasis has either been reduced bychemotherapeutical intervention, or where the epidemic is being freshly imported. Since diagnosis in the field has to be performed under most simple conditions, it was aimed to make the technique as simple and safe aspossible. It was sucessfully tested by using whole blood instead of patient serum, and the small quantity of blood needed can be collectedand dryed on filter paper. Because in this case no needles are needed for blood collection, the risk of accidental infection of the afflictedpopulation as well as of the medical staff by viral diseases has considerable been reduced. Finally, there was a marked success to make the diagnostic method faster. A new method to conjugate protein A from Staphylococcusaureus to a carbon colloid has been developed. This conjugate can be used to detect antigen-antibody-complexes during the immune testwithin as few as 15 minutes with the same sensitivity as with the line blot.