Vergleichende Untersuchungen zum Hämozytenbild von Larve und Puppe des Tabakschwärmers Manduca sexta L.

Abstract

Ziel meiner Dissertationsarbeit waren 'Vergleichende Untersuchungen zum Hämozytenbild von Larve und Puppe des TabakschwärmersManduca sexta'. Dabei wurden insbesondere die Blutzellen während der ersten Tagen des letzten Larvenstadiums und der ersten Tagedes Puppenstadiums miteinander verglichen. Zwischen diesen beiden Zeitpunkten beginnt die Metamorphose, was ein"Umprogrammieren" vieler Zellen und Gewebe im Insektenorganismus bedeutet.Als die Aufgabenstellung der Dissertation formuliert wurde, war über die Hämatopoiese der Insekten und speziell der Lepidoptera wenigbekannt. Die Nomenklatur der Hämozyten war nicht einheitlich. Daher war die bis dahin veröffentlichte Literatur nur schwer vergleichbar undteilweise sogar widersprüchlich. Jüngste Forschungsergebnisse auf dem Gebiet der zellulären Immunität bei Insekten und deutlicheHinweise auf Zusammenhänge zwischen immunologischen und entwicklungsbiologischen Prozessen rückten die Hämozyten erneut in denMittelpunkt entwicklungsbiologischer Forschung.Zunächst wurde die Morphologie der Hämozyten der Larven und Puppen vergleichend licht- und elektronenmikroskopisch untersucht. InLarven wurden Plasmatozyten, granuläre Zellen, sphärule Zellen und Oenozytoide unterschieden, in Puppen dagegen nur Plasmatozytenund granuläre Zellen. Die pupalen Hämozyten unterschieden sich zudem in ihren Eigenschaften von ihren larvalen Gegenstücken. Auch dieZellzahlen in der Hämolymphe änderten sich. Während Plasmatozyten und granuläre Zellen zu Beginn des letzten Larvenstadiums ähnlichhäufig auftraten, überwogen Plasmatozyten in der Hämolymphe der Puppen.Das Kernstück meiner Arbeit war die Charakterisierung der Hämozyten durch monoklonale Antikörper und Lektine. Dabei wurden alle zurVerfügung stehenden 214 monoklonalen Antikörper aus der Arbeit von WILLOTT et al. (1994) und deren Subklone genutzt. 28 monoklonaleAntikörper zeigten Markierungsunterschiede im Vergleich zwischen Larven- und Puppenhämozyten. Diese Muster wurden zu 10Kategorien zusammengefasst. Daneben wurden 14 Lektine getestet, zwei davon banden unterschiedlich an larvale und pupale Hämozyten.Im folgenden wurden die korrespondierenden Antigene / Liganden biochemisch charakterisiert und die Hämozytenspezifität dieserAntikörper / Lektine bzw. Kreuzreaktivität gegen andere Gewebe incl. des Hämolymphplasmas bestimmt.Ein Antikörper und ein Lektin mit jeweils eindeutiger Hämozytenspezifität und einer distinkten Bande in der Western-Blot-Analyse derHämozytenlysate wurden ausgewählt, um den entsprechenden Liganden zu isolieren und zu identifizieren. Beides waren integraleMembranproteine, die Proteinreinigungsversuche erwiesen sich daher als schwierig. Ähnliche Untersuchungen bei anderen Insektenartenlassen vermuten, daß es sich bei dem Liganden des Lektins um ein Mucin handelt. Der Anitkörper bindet vermutlich an ein Integrin.Daneben wurden weitere Methoden angewendet, um Unterschiede zwischen larvalen und pupalen Hämozyten zu finden. Besonders dieAuftrennung der Hämozytenproteine durch zweidimensionale Elektrophorese ist eine vielversprechende Methode, um unterschiedlichexprimierte Proteine in Larven- und Puppenhämozyten zu identifizieren. Diese Methode konnte während der Arbeit so weit optimiertwerden, daß zumindest im pH-Bereich 4-7 eine auswertbare Auftrennung der Proteine gelang.Parallel dazu wurde die Percolldichtegradientenzentrifugation angewendet, um Gesamthämozyten aus Larven und Puppen in einzelneFraktionen, d.h. in die unterschiedlichen Hämozytentypen zu trennen. Pupale Plasmatozyten und granuläre Zellen konnten eindeutiggetrennt werden. Bei larvalen Hämozyten gelang zumindest eine Anreicherung bestimmter Typen. Die Kombination ausPercolldichtegrandientenzentrifugation und 2D-Elektrophorese ist vielversprechend, um spezifisch exprimierte Proteine der einzelnenZelltypen zu identifizieren. Erste Versuche dazu liegen vor.Für ergänzende Untersuchungen wurde die in vitro-Primärkultivierung von Hämozyten etabliert. Diese Methode wurde u.a. dazu benutzt, umden direkten Einfluß von b-Ecdyson auf die Hämozyten zu untersuchen.Im Verlauf der Arbeit wurden verschiedene Hypothesen bezüglich Hämatopoiese sowie Differenzierung und Funktion der Blutzellenentwickelt und getestet. In diese Untersuchungen wurde auch das hämatopoietische Organ einbezogen. Eine der wesentlichenBeobachtungen dabei war, daß Plasmatozyten vermutlich aus Vorläuferzellen aus dem hämatopoietischen Organ entstehen. Unter den freiflottierenden waren die mitotisch aktiven Zellen zumeist granuläre Zellen.