Identifizierung eines zellulären Rezeptors für das Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) : Reinigung, Klonierung und Expression des bovinen CD46 (MCP)

Abstract

Zusammen mit dem Virus der klassischen Schweinepest (CSFV) und dem 'border disease' Virus (BDV) bildet das Virus der bovinenviralen Diarrhöe (BVDV) das Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae. Es handelt sich hierbei um behüllte RNA Viren mit einemeinzelsträngigen Genom positiver Polarität. Obwohl in der Literatur mehrere Ansätze zu der Identifizierung spezifischer zellulärerRezeptoren existierten, war über die frühen Ereignisse bei der Infektion von Wirtszellen mit BVDV zu Beginn dieser Arbeit wenig bekannt.Neben Hinweisen auf Analogien der Invasionsmechanismen von CSFV und BVDV wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen mehrerezelluläre Oberflächenproteine beschrieben, die mit Ereignissen der BVDV Infektion boviner Zellen verknüpft waren. Über diese Proteinegab es, abgesehen von ihrer Verbreitung in verschiedenen Zelltypen und ihren apparenten Molekulargewichten, jedoch keine Information. Für die Isolierung mutmaßlicher Virusrezeptoren für BVDV wurde der monoklonale Antikörper mAk 17, der zwei Proteine (60kD und 93kD)auf bovinen Zellen erkannte, verwendet. Analog zu den in der Literatur beschriebenen Experimenten hemmte eine Vorinkubation derWirtszellen mit mAk 17 die BVDV Infektion effektiv. Bei den hier verwendeten Versuchsbedingungen wurde allerdings eine nichthemmbare Residualinfektion detektiert, die weder von der eingesetzten Virusmenge noch von der Antikörperkonzentration während derVorinkubation abhängig war. Als Ausgangsmaterial für die Reinigung der bovinen Zelloberflächenproteine mittelsImmunaffinitätschromatographie diente Kalbsthymus. Am Ende der aufwändigen Reinigungsprozedur lag mehr als ein Milligramm des 60kD Proteins in ausreichender Reinheit für weitere proteinchemische Analysen vor.Mit Hilfe der durch interne Aminosäuresequenzierung ermittelten Peptidsequenz CV(X)PAIEHGTIVSGFGPK wurde eine allgemeinzugängliche Proteinsequenzdatenbank durchsucht, wobei ein mögliches Homologes aufgefunden wurde. Alle biochemischenEigenschaften des gut beschriebenen humanen 'membrane cofactor protein' (MCP, CD46) stimmten mit denen des gesuchten bovinenProteins überein. Zudem war seine Funktion als Rezeptor für andere Pathogene (Viren und Bakterien) beschrieben worden. Von derbekannten Sequenz des porzinen CD46 konnte eine DNA Sonde abgeleitet werden, die mit einer bovinen mRNA spezifisch reagierte.Durch das 'screening' einer Genbank mit Hilfe dieser Sonde gelang die Klonierung des bovinen CD46. Vergleiche der von der kloniertencDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz mit CD46 Sequenzen anderer Spezies zeigten entsprechende Übereinstimmungen. Ebensokonnten die durch Analyse des gereinigten Proteins gewonnenen Peptidsequenzen aufgefunden werden. Das heterolog exprimierte bovineCD46 konnte durch den Antikörper mAk 17 auf der Oberfläche von BHK-21 Zellen nachgewiesen werden, wobei keine strukturellenAbweichungen zu dem natürlich vorkommenden Protein auffielen.Um die Funktion des bovinen CD46 bei der Infektion mit BVDV untersuchen zu können, wurde es in verschiedenen Zelllinien stabilexprimiert. Es handelte sich hierbei einerseits um nicht-infizierbare Zelllinien (HeLa, BHK-21, L-Zellen), andererseits um die porzineZelllinie PK15, die prinzipiell mit BVDV infizierbar ist. Die Infektionseffizienz von BVDV auf diesen Zellen war im Vergleich mit bovinenZellen jedoch um den Faktor 100 niedriger. Es stellte sich heraus, dass die Expression des bovinen CD46 nicht ausreichte, um dienicht-infizierbaren Zellen für das BVD Virus zugänglich zu machen. Bei den PK15 Zellen konnte jedoch durch Expression des bovinenCD46 die Infektionseffizienz deutlich gesteigert werden, ein Effekt, der durch die Vorinkubation mit anti-CD46 Antikörpern verhindertwerden konnte. Besonders im Zusammenhang mit Ergebnissen anderer Veröffentlichungen weisen diese Daten darauf hin, dass derEintritt des BVD Virus in seine Wirtszellen durch ein Zusammenspiel mehrerer zellulärer Faktoren vermittelt wird. Neben CD46 erscheinendaher zusätzliche zelluläre Faktoren für eine erfolgreiche Infektion essentiell. Weitere Aufklärung des Infektionsmechanismus von BVDVkann in Zukunft durch die Identifikation des (der) Kofaktor(en) erfolgen.