Identifizierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Determinanten der Suszeptibilität und Resistenz im Pathosystem Gerste / Echter Gerstenmehltaupilz

Abstract

Der Echte Gerstenmehltaupilz, Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh), ist ein obligatbiotropher Ektoparasit der Gerste (Hordeum vulgare L.). Die Penetration derEpidermiszellwand durch den Pilz ist Voraussetzung zur Einstülpung der Plasmamembranund der nachfolgenden Etablierung von Haustorien, die der Ernährung des Pathogens dienen.Zur Verhinderung der Penetration der Zellwand verfügt die Gerste unter anderem über einapoplastisch wirkendes Abwehrsystem. Die Expression des apoplastischen pathogenesis related(PR) Protein 1B in Gerstenblättern nach Bgh Inokulation korrelierte zeitlich und räumlichmit den Resistenzreaktionen verschiedener anfälliger und resistenter Gerstenlinien. Zurfunktionellen Analyse wurde die Expression von PR-1b durch RNA Interferenz mittels transienterbiolistischer Transformation von PR-1b-dsRNA inhibiert. Da der transiente knockdownvon PR-1b die Penetrationsresistenz der Gerste erniedrigte, handelt es sich bei PR-1Bwahrscheinlich um ein Protein des extrazellulären Pathogenabwehrkomplexes. Viele Erreger beeinflussen pflanzliche Signaltransduktionskaskaden, um bestimmte physiologischeEigenschaften der Wirtszelle wie zum Beispiel den Aufbau des Zytoskeletts und denRedoxzustand ihren Bedürfnissen anzupassen. An diesen Prozessen sind in tierischen wieauch in pflanzlichen Systemen kleine G-Proteine der RAC/ROP Familie beteiligt. In einemPCR-basierten Kandidatengenansatz wurden sechs unterschiedliche Gersten-cDNA-Sequenzenidentifiziert, die für RAC/ROP Proteine der Gerste kodieren. Der transiente knock-downvon RACB durch RNA Interferenz erhöhte die Penetrationsresistenz von Wildtyp Gerstenliniengegenüber Bgh. In Gerstenlinien, die einen Defekt im Ror1- Gen aufweisen, zeigte derknock-down von RACB jedoch keinen Effekt. Dies bedeutet, dass die durch RNAi von RacBvermittelte Resistenz, ebenso wie die mlo-Resistenz von funktionellem ROR1 abhängig ist.Die Überexpression von konstitutiv aktiviertem RACB, RAC3, ROP4 und ROP6 führte zu einererhöhten Anfälligkeit von Gerste gegen Bgh, während die Überexpression von konstitutivaktivem RAC1 und RACD keinen Einfluss auf die Gerste - Bgh Interaktion zeigte. Somitsind einige der kleinen G-Proteine spezifische Suszeptibilitätsfaktoren in der Regulation derPenetrationsresistenz von Gerste gegen Bgh. Die intrazelluläre Lokalisation vonGFP:RAC/ROP Fusionsproteinen zeigte eine konstitutive Assoziation aller RAC/ROPProteine mit der Plasmamembran. Diese ist für die Funktion der RAC/ROP Proteineessentiell, da die Verhinderung der Plasmamembranassoziation durch Mutagenese derLokalisationsdomäne mit einem Verlust der Suszeptibilität-erhöhenden Funktion in derGerste - Bgh Interaktion einhergeht. The biotrophic barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh) attacksepidermal cells of barley (Hordeum vulgare L.). The first step of pathogenesis is thepenetration of the cell wall and the invagination of the plasma membrane followed by theestablishment of a haustorium, which is required for nutrition of Bgh. Accordingly the firstline of defence against Bgh is represented by an apoplastic defence system. The expression ofthe apoplastic pathogenesis related (PR) protein 1B correlates temporally and spatially withthe onset of defence reactions in near-isogenic barley lines exhibiting various forms ofdefence phenotypes including papilla formation and the hypersensitive cell death. Toelucidate PR-1B function, PR-1b expression was transiently silenced by double stranded RNA(dsRNA) interference using microprojectile mediated transformation of single barleyepidermal cells and observed a decreased penetration resistance of barley to Bgh. Thisindicates that PR-1B is part of the apoplastic defence machinery.The early interaction of barley and powdery mildew is accompanied by the remodelling of thecytoskeleton and the accumulation of reactive oxygen species (ROI). Small G-Proteins areknown to be involved in the production of superoxide (O2.-) and the assembly of actin fibres. Using a candidate RT-PCR approach six cDNAs were identified coding for RAC/ROPproteins of barley. The transient knock-down of RacB led to a lower penetration efficiency upto 60 % in susceptible barley lines. Surprisingly the inhibition of RacB expression had noeffect in mutant barley lines lacking the Ror1 gene. That leads to the assumption that theRacB RNAi effect is dependent on a functional ROR1 that is also required for broad-spectrummlo-mediated resistance to Bgh. The overexpression of constitutively activated (CA) mutant RAC/ROP proteins led to aRAC/ROP-specific enhancement of accessibility to Bgh. The overexpression of CA RACB,CA RAC3, CA ROP4 and CA ROP6 enhanced the accessibility of barley to Bgh. Because CARACD and CA RAC1 did not influence barley - Bgh interaction, it seems that some of theRAC/ROP proteins might be specific susceptibility factors, involved in processes supportingparasitic entry into epidermal host cells. Confocal laser scanning microscopy ofGFP:HvRAC/ROP transformed cells revealed varying strengths of plasma membraneassociationof barley RAC/ROPs. The C-terminal localisation domain was essential formembrane association and proper function of the RAC/ROPs in inducing accessibility ofbarley to Bgh.