Identification of a protein factor shared by the recycling pathways of U2- and U12-type spliceosomes

Abstract

Pre-mRNA splicing takes place in a large ribonucleoprotein complex, the spliceosome, which contains five small nuclear ribonucleoprotein complexes (snRNPs) and over 100 protein factors. There are two types of introns, the major- and the minor-type, that are excised by two different spliceosomes, assembled by two distinct sets of snRNPs: U1, U2, U4, and U6 snRNPs are required for splicing of the major-type introns; U11, U12, U4atac, and U6atac are their corresponding counterparts, involved in minor-type intron splicing. U5 snRNP is common for both spliceosomes. U4 and U6 snRNAs enter the spliceosome in the form of the U4/U6.U5 tri-snRNP, in which they are extensively base-paired. After splicing, U4 and U6 are released as singular snRNPs. In order to restore the tri-snRNP that can participate in another round of splicing, the U4/U6 hybrid must be recycled. The Prp24 protein in the yeast system, and its distant human homologue p110 have been identified as U4/U6 recycling factors and as specific protein components of U6 and U4/U6 snRNPs.This work focuses on the recycling the minor spliceosome and of the minor spliceosomal U4atac/U6atac snRNP. Using a recycling assay coupled to splicing in vitro, p110 was demonstrated to function also as U4atac/U6atac recycling factor. p110 was detected in U6atac snRNP. In contrast to the major U4/U6, however, it is associated only at background levels with U4atac/U6atac snRNP. Interestingly, U4/U6 and U4atac/U6atac hybrids can be also disrupted independently of splicing in vitro. This process may provide a mechanism to control splicing rates in vivo.The sequence elements of U6 and U6atac snRNA, required for interaction with p110 were identified: U6 nucleotides 38 to 57, and U6atac nucleotides 10 to 30 are sufficient for p110 binding. These regions are the most highly conserved between U6 and U6atac.Finally, singular U6 snRNP was purified from HeLa S100 extract. It contained a novel protein, p85 (cDNA GenBank accession AK001239), identified by mass-spectrometric analysis. p85 localizes to the nucleoplasm, and associates not only with U6, but also with U2 snRNA, and 5S and 5.8S rRNAs. This protein is weakly similar to the yeast rRNA processing factor NOP4, which implicates a function of p85 in maturation of U2 and U6 snRNAs. mRNA-Spleißen findet in einem großen Ribonukleoproteinkomplex (RNP) statt, dem Spleißosom, das sich aus 5 kleinen nukleären RNPs (snRNPs) und über 100 Proteinfaktoren zusammensetzt. Es gibt zwei Klassen von Introns, die sogenannten major- und minor-Introns, die von zwei verschiedenen Spleißosomen prozessiert werden. Diese enthalten unterschiedliche Gruppen von snRNPs: U1, U2, U4 und U6 snRNPs werden für das Spleißen von major-Introns benötigt; U11, U12, U4atac und U6atac bilden die funktionsanalogen snRNPs, welche für das Spleissen von minor-Introns essentiell sind. Der U5 snRNP dagegen kommt in beiden Spleissosom-Formen vor. Die U4 und U6 snRNAs werden in das Spleißosom in Form des U4/U6.U5 tri-snRNPs integriert, in welchem sie eine ausgedehnte Basenpaarung aufweisen. Nach Ablauf der Spleissreaktion werden U4 und U6 separat voneinander freigesetzt. Um daraus den tri-snRNP für weitere Runden der Spleißreaktion zu bilden, muß zunächst der U4/U6-Hybrid durch eine Recycling-Reaktion wiederhergestellt werden. Im Hefesystem wurde das Prp24-Protein, im Humansystem dessen verwandtes Protein p110 als U4/U6-Recyclingfaktor identifiziert und als spezifische Proteinkomponente der U6 und U4/U6 snRNPs. Diese Arbeit konzentriert sich auf das Recycling der U4atac und U6atac snRNPs. Mit Hilfe eines mit der Spleissreaktion gekoppelten in vitro-Assays konnte gezeigt werden, daß p110 auch als U4atac/U6atac Recyclingfaktor wirkt. Das p110-Protein wurde im U6atac snRNP nachgewiesen; im Gegensatz zum normalen U4/U6 snRNP ist p110 nur minimal mit dem U4atac/U6atac snRNP assoziiert. Interessanterweise können die U4/U6- und U4atac/U6atac-Hybride auch unabhängig von der in vitro-Spleissreaktion gespalten werden. Dieser Prozeß stellt in vivo möglicherweise einen Kontrollmechanismus der Spleißreaktion dar. Die für die p110-Interaktion notwendigen Sequenzelemente der U6 und U6atac snRNAs wurden kartiert: p110 benötigt Positionen 38-57 in U6 bzw. 10-30 in U6atac. Diese Bereiche sind zwischen den U6 und U6atac snRNAs am stärksten konserviert. Der singuläre U6 snRNP wurde außerdem biochemisch aus HeLa S100-Extrakt gereinigt. Als eine neue Komponente wurde ein Protein, p85, mittels Massenspektrometrie identifiziert (cDNA GenBank accession AK001239). Diese Protein befindet sich im Nukleoplasma und liegt nicht nur mit U6 snRNA gebunden vor, sondern auch mit U2 sowie 5S und 5.8S ribosomaler RNA. p85 zeigt eine geringe Ähnlichkeit mit dem an der ribosomalen RNA-Prozessierung beteiligten NOP4-Faktor aus der Hefe, was eine Funktion von p85 bei derReifung der U2 und U6 snRNAs nahelegt.