Redox-spezifische Regulation der löslichen Guanylyl Cyclase durch Liganden der Hämbindungstasche und ihre pharmakologische Bedeutung

Abstract

Aktivierung der sGC durch NO stellt die Grundlage des NO-cGMPSignaltransduktionsweges dar. Es konnte bisher in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass Substanzen mit reduzierendem oder mit oxidierendem Effekt einen Einfluss auf die sGC-Regulation haben können. Die prosthetische Hämgruppe spielt eine zentrale Rolle in der Regulation sGC-Aktivität. Die Rolle der oxidativen Zustände des Häms in der Regulation der sGC-Stabilität und -Proteinlevel ist unklar. Die Anwesenheit der oxidierten sGC bei physiologischen (pathophysiologischen) Zuständen ist fraglich. Oxidation des Hämseisens oder Entfernung des Häms führt zum Verlust der NO-stimulierten Aktivität der sGC. Aus diesem Grund wurde bis jetzt nur die reduzierte sGC als aktive Form der sGC und als pharmakologisches Target betrachtet. Vor kurzem aber wurde eine Substanz beschrieben (BAY58-2667), die sGC NO- und Häm-unabhängig aktiviert. Es war aber nicht klar, welche Form der sGC (reduzierte und oxidierte) durch BAY58-2667 aktiviert wird. Diese Frage hat nicht nur eine äußerst wichtige Bedeutung für unser Verständnis der Regulation dieses Enzyms, sondern auch eine potentielle pharmakologische Relevanz. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Aufklärung der verschiedenen Mechanismen der Redox-Regulation der sGC durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass BAY58-2667 nicht nur Häm-freie sGC aktiviert, sondern auch deren Abbau verhindert und so die sGC-Proteinmenge reguliert. sGCInhibitoren wie ODQ oder MB scheinen demgegenüber, ähnlich wie chronische NOExposition, das Häm der sGC zu oxidieren und diese so zu inaktivieren und ihren Proteinlevel zu reduzieren. Dabei entstehen interessanterweise höhermolekulare Aggregate. Die Hauptbefunde der vorliegenden Arbeit sind im Folgenden aufgeführt: 1. Ausschließlich oxidierte Häm-freie sGC ist für die pharmakologischen Effekte von BAY58-2667 verantwortlich. 2. Hämoxidierende Substanzen wie ODQ oder MB führen zur Destabilisierung der sGC. BAY58-2667 stabilisiert oxidierte und Hämfreie sGC und stimuliert auch ihre Aktivität. 3. Oxidation des sGC-Häms führt zur Bildung eines hochmolekularen SDS-resistenten Komplex von sGC1 und sGC1 (p160). Dabei spielt Hämoxidation eine wichtige Rolle. Anderseits, wenn sGC durch ODQ oxidiert wird, verhindert die gleichzeitige Behandlung mit BAY58-2667 die Bildung von p160. 4. Biochemischen Daten zeigen, dass der Verlust von sGC-Aktivität und - Proteinlevel, welcher durch SIN-1 bewirkt wird, durch BAY58-2667 erfolgreich kompensiert werden kann. Physiologische Versuche mit isolierten Gefäßen bestätigen, dass BAY58-2667 auch die Gefäßrelaxation unter oxidativen Bedingungen verbessern konnte. Activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) by nitric oxide represents the basis of NO-cGMP signalling pathway. Several studies have demonstrated that substances with reduce of oxidizing properties may affect regulation of sGC. The prosthetic heme group of sGC plays the central role in regulation of the enzyme activity. The role of oxidative state of heme in the regulation of sGC stability and protein level is unclear. It is also unclear whether oxidized or heme-deficient sGC is present in vivo under physiological or pathophysiological conditions. However, it is known that pharmacological oxidation of the heme iron of sGC results in a loss of NO-stimulated sGC activity. Therefore, only reduced heme-containing sGC has been considered so far as a target for pharmacological intervention. Recently, a substance (BAY58-2667) has been described which is able to activate sGC NO- and heme-independently. However, it has not been clarified by previous studies whether both reduced and oxidized, or only oxidized sGC is the activated by the drug. This question is extremely important for our understanding of the sGC regulation and also has a pharmacological relevance. In the present study, experiments were performed to clarify different aspects of redox-regulation of sGC. It has been demonstrated that BAY58-2667 does not only activate sGC heme-independently, but also attenuates sGC degradation and regulates sGC protein level. In contrast, sGC inhibitors such as ODQ or methylene blue as well as chronical exposure towards NO, appear to oxidize sGC heme inactivating the enzyme and down-regulate its expression level. This is accompanied by formation of SDS-resistant aggregates of sGC. The main findings of the present study are: 1. Solely oxidized or heme-deficient sGC is responsible for pharmacological effects of BAY58-2667. 2. Heme-oxidizing compounds like ODQ or methylene blue destabilize sGC. This could be prevented by BAY58-2667. 3. Oxidation of sGC by ODQ results in formation of high-molecular weight complexes of sGC1 and sGC1 (p160). Oxidation of sGC heme plays a key role in this process. Interestingly, BAY58-2667 presented during treatment prevents formation of p160. 4. Biochemical studies suggests that SIN-1-induced lost of sGC activity and protein level could be successfully prevented by BAY58-2667. Experiments with isolated vessels supports that potency of BAY58-2667 to produce vasodilation increases under oxidative conditions.