Integration of redox and light signals by the regulator protein AppA in Rhodobacter sphaeroides

Abstract

The AppA protein in Rhodobacter sphaeroides is an antagonist of the transcriptional repressor protein PpsR, which can block the transcription of several photosynthesis genes through binding to a consensus sequence. To date, the AppA protein is unique in its ability to sense and transmit both light and redox signals. The AppA protein consists of an N-terminal FAD-binding domain, recently named BLUF (sensors of blue light using FAD), and a C-terminal domain, which is involved in the light- and redox-dependent regulation of photosynthesis genes. The BLUF domain is a new family of blue light photoreceptors and it is present either in multidomain proteins or as a short protein only consisting of the BLUF domain. Recently, four BLUF domains have been found in the photoreceptor protein photoactivated adenylyl cyclase (PAC) from the eukaryotic organism Euglena gracilis. Each BLUF domain is linked to a downstream domain whose function is completely different from that of the C-terminal domain of AppA. In this work, a hybrid protein containing one of the BLUF domains from the PAC protein and the C-terminal domain of AppA was expressed in R. sphaeroides and the function of this hybrid protein was investigated. The results showed that the BLUF domain from the PAC protein can fully replace the AppA-BLUF domain in the light-dependent signaling. Moreover, this work revealed that the signal transmission by AppA does not require covalent linkage of the BLUF domain and the C-terminal domain. These two observations demonstrate that the BLUF domain is fully modular and can relay signals to completely different output domains. It was previously assumed that the small BLUF-containing proteins transfer the light-dependent signals to other proteins by protein-protein interactions. The interaction between the BLUF domain and the C-terminal domain of AppA revealed in this work supports this assumption. The previous studies have shown that AppA interacts with PpsR and inhibits the repressor activity of PpsR. However, the interacting domains of AppA and PpsR have not been determined. It was found in this study that the C-terminal domain of AppA is sufficient to inhibit the DNA-binding activity of PpsR in vivo and in vitro. This observation indicates that the binding site between AppA and PpsR must be located at the C-terminal domain of AppA. Furthermore, surface plasmon resonance (SPR) based interaction studies demonstrate that the C-terminal domain of AppA can interact with PpsR in the absence of the BLUF domain. In addition, this work presented the first evidence that the C-terminal domain of AppA contains a heme as the redox sensitive prosthetic group. Mutant analysis revealed that some of the amino acids in the heme-binding domain are essential for the function of AppA. It was also found that the cofactor heme affects not only the interaction of the C-terminal domain of AppA with PpsR but also the interaction of the C-terminal domain of AppA with the BLUF domain. These data demonstrate that the cofactor heme plays a key role in the light- and redox-dependent signaling. Besides the AppA/PpsR system, several other regulatory systems in R. sphaeroides also control the expression of photosynthesis genes according to light and redox conditions. Thus, the interplay between the AppA/PpsR system and other systems was investigated in this work. The results showed that i) the AppA/PpsR system is the major contributor that mediates the expression of photosynthesis genes in response to light, ii) the PrrB/PrrA system is sufficient to activate photosynthesis gene expression in response to the decrease of oxygen and the redox-dependent regulation by the AppA/PpsR system requires the presence of the PrrB/PrrA system, and iii) the deficiency of thioredoxin causes the increase in the redox potential and consequently affects the AppA-PpsR system in light-dependent signaling. Das AppA Protein aus Rhodobacter sphaeroides ist ein Antagonist des Transkriptions¬repressor-Proteins PpsR, das die Transkription verschiedener Photosynthesegene durch Bindung an eine spezifische DNA Erkennungssequenz unterbindet. Die Fähigkeit, sowohl Licht- als auch Redox Signale zu messen und weiterzuleiten, ist bislang nur von AppA bekannt. Das AppA Protein besteht aus einer N-terminalen FAD-Bindedomäne, die als BLUF (blue light using FAD Sensor) bezeichnet wird, und einer C-teminalen Domäne, die an der licht- und redoxabhängigen Regulation von Photosynthesegenen beteiligt ist. Die BLUF Domäne stellt eine neue Familie innerhalb der Blaulichtrezeptoren dar und ist entweder Bestandteil eines Proteins mit mehreren Domänen oder ein kleines Protein, das nur die BLUF Domäne beinhaltet. Kürzlich wurden vier BLUF Domänen in dem Photorezeptor-Protein PAC (Photoaktivierte Adenyl Cyclase) des eukaryotischen Organismus Euglena gracilis beschrieben. Jede der BLUF Domänen ist downstream an eine Domäne mit gänzlich anderer Funktion als der C-terminale Bereich von AppA gekoppelt. In dieser Arbeit wurde ein Hybridprotein mit einer der BLUF Domänen des PAC Proteins und der C-terminalen Domäne des AppA Proteins in R. sphaeroides exprimiert und die Funktion dieses Hybridproteins untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die BLUF Domäne des PAC Proteins die Funktion der lichtabhängigen Signalwahrnehmung und -weiterleitung der AppA-BLUF Domäne vollständig ersetzen kann. Darüberhinaus zeigt diese Arbeit, dass die Signalübertragung durch AppA keine kovalente Bindung der BLUF Domäne mit der C-terminalen Domäne erfordert. Diese beiden Beobachtungen demonstrieren, dass die BLUF Domäne gänzlich modular aufgebaut ist und Signale an unterschiedlichste Ausgabedomänen weitergeleitet werden können. Es wurde vermutet, dass kleine Proteine, die eine BLUF Domäne enthalten, lichtabhängige Signale mittels Protein-Protein Interaktion auf andere Proteine übertragen. Diese Vermutung wird durch die gezeigte Interaktion zwischen der BLUF Domäne und der C-terminalen Domäne von AppA unterstützt. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass AppA mit PpsR interagiert und die Repressoraktivität von PpsR inhibiert. Die interagierenden Domänen von AppA und PpsR wurden jedoch noch nicht bestimmt. Diese Studie zeigt, dass die C-terminale Domäne von AppA ausreicht, die DNA bindende Aktivität von PpsR sowohl in vivo als auch in vitro zu inhibieren. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Bindungstelle zwischen AppA und PpsR in der C terminalen Domäne von AppA lokalisiert sein muss. Außerdem zeigten Oberflächenplasmonresonanz (SPR) basierte Interaktionsstudien, dass die C-terminale Domäne von AppA auch in der Abwesenheit der BLUF Domäne mit PpsR ineragieren kann. Darüberhinaus gibt diese Arbeit den ersten Hinweis darauf, dass die C-terminale Domäne des AppA Proteins ein Häm als redox-sensitive prosthetische Gruppe enthält. Mutationsanalysen zeigten, dass einige Aminosäuren in der Häm-bindenden Domäne essentiell für die Funktion von AppA sind. Es wurde auch gezeigt, dass der Kofaktor Häm nicht nur die Interaktion der C-terminalen Domäne von AppA mit PpsR beeinflusst, sondern auch die Interaktion zwischen der C-terminalen Domäne von AppA und der BLUF Domäne. Diese Daten verdeutlichen, dass Häm als Kofaktor eine Schlüsselrolle in der licht- und redoxabhängigen Signalübertragung zukommt.Neben dem AppA/PpsR System sind mehrere andere Regulationssysteme in R. sphaeroides an der Kontrolle der Expression von Photosynthesegenen in Abhängigkeit von Licht und Redox Bedingungen beteiligt. Daher wurde die Wechselwirkung zwischen dem AppA/PpsR System und anderen Systemen in dieser Arbeit untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass a) das AppA/PpsR System der bedeutendste Regulator der Expression der Photosynthesegene im Rahmen einer Lichtantwort ist, b) das PrrB/PrrA System ausreicht, um die Expression der Photosynthesegene in Antwort auf ein Absenken des Sauerstoffgehalts zu aktivieren, wobei die Anwesenheit des PrrB/PrrA Systems für die redox-abhängige Regulation durch AppA/PpsR benötigt wird, und c) das Fehlen von Thioredoxin einen Anstieg des Redox-Potentials bewirkt und somit das AppA/PpsR System in der licht-abhängigen Signalwahrnehmung beeinflusst.