Charakterisierung der Funktion von NOD2/CARD15 für die bakterielle Translokation im Kolon bei Morbus Crohn

Abstract

Der humane Darm steht dem Darmlumen mit nur einer einlagigen Epithelschicht als selektive Barriere gegenüber. Dieses Epithel muss einerseits die Passage potentiell toxischer/pathogener Substanzen in den Wirt verhindern, andererseits aber die digestiv-resorptive Nahrungsassimilation erlauben. Epithelschädigungen können zu einem unphysiologischen Antigeneinstrom in die Darmwand führen. Zur direkten Erkennung und Abwehr von Pathogenen bedient sich der Organismus spezifischer Rezeptoren (PRRs), welche molekulare Muster verschiedener Pathogene (PAMPs) erkennen. Die NOD-Proteinfamilie stellt intrazelluläre Sensoren bakterieller PAMPs dar, deren Vertreter NOD2/CARD15 als Suszeptibilitätsgen für Morbus Crohn (MC), einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung, identifiziert wurde. Der direkt NOD2/CARD15-vermittelte Signalpfad endet in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB, welcher die Expression proinflammatorischer Zytokine induzieren kann. Die Ätiopathogenese des MC ist bis heute nicht vollständig geklärt. Neben genetischen und ökologischen Faktoren scheint vor allem die luminale Flora zur Entstehung der chronischen Darmentzündung beizutragen. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Bedeutung von NOD2/CARD15 für die bakterielle Translokation in das intestinale Gewebe bei MC zu untersuchen. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Translokation luminaler Bakterien(produkte) in das (sub)epitheliale Gewebe eine Vielzahl von Signalwegen induziert, welche die Darmentzündung fördern und aufrechterhalten können. Der NOD2/CARD15-Genotyp der Patienten scheint dabei vor allem für die NF-kB-vermittelten Immunreaktionen eine wichtige Rolle zu spielen. Orale Toleranz verhindert eine Immunantwort gegen Nahrungsmittelantigene und die kommensale Darmflora. Bei MC-Patienten ist diese Toleranz gestört, wodurch es zu einer hyperreaktiven, NF-kB-vermittelten Immunantwort kommt. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zum Einfluss der bakteriellen Translokation auf die Regulation der intrazellulären Sensorproteine NOD2/CARD15 und Nalp3 sowie die intestinale Entzündung bei MC zeigten, dass (i) die bakterielle Zellwandkomponente Muramyldipeptid (MDP) den NOD2/CARD15-Promotor sowie die NOD2/CARD15 Genotyp-spezifische Aktivierung des NF-kB Signalweges in vitro induziert, (ii) es im intestinalen Gewebe von MC-Patienten zu einer NOD2/CARD15 Genotyp-spezifischen Aktivierung von NF-kB kommt und (iii) es in intestinalen Epithelzellen und Makrophagen (IMAC) von MC-Patienten zur Erhöhung von Nalp3-mRNA und -Protein kommt. Nalp3 bildet einen Proteinkomplex, das Nalp3 Inflammasom, welches eine molekulare Plattform für die Aktivierung der proinflammatorischen Caspase-1 darstellt. Die durch Nalp3-Aktivierung induzierte Prozessierung der pro-Caspase-1 sowie Reifung von IL-18 konnte nachgewiesen werden. Die Unterschiede im Nalp3-Gehalt der IMAC konnten im multizellulären Sphäroidmodell bestätigt werden. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die übermäßige bakterielle Stimulierung in IMAC bei MC in einer Fehlregulation gewebezerstörender Enzyme resultiert: die Aktivität der NADPH-Oxidase und somit Produktion reaktiver Sauerstoffmetabolite war in IMAC bei MC erhöht und der CTSB- und CTSL-mRNA-Gehalt konnte in vitro durch Stimulierung mit MDP signifikant gesteigert werden. Eine erhöhte Menge CTSB- und CTSL-mRNA und -Protein wurde auch in IMAC und im Gewebe von MC-Patienten detektiert. Durch Hemmung der Enzymaktivitäten von CTSD und CTSB/CTSL konnte im experimentellen DSS-Colitismodell in vivo ein neuer Therapieansatz für CED generiert werden. Durch mikrobielle Stimuli kommt es bei MC zusätzlich zur Veränderung autoprotektiver Schutzmechanismen des Darmepithels. Nachdem gezeigt werden konnte, dass der intestinale Mukus von MC-Patienten eine starke bakterielle Adhärenz aufweist, wurde untersucht, ob diese auch zur Translokation in das intestinale Gewebe führen kann. Die Akkumulation von Endotoxin im intestinalen Gewebe von MC-Patienten wies ebenfalls NOD2/CARD15-Genotyp-spezifische Unterschiede auf. Als mögliche Translokationsroute wurden die Zell-Zell-Kontakte aufgedeckt. Zusammenfassend zeigen die Daten der vorliegenden Arbeit, dass bei Morbus Crohn eine Translokation luminaler Bakterien(produkte) durch Überwindung der epithelialen Zell-Zell-Kontakte stattfindet. Intrazelluläre bakterielle Stimulierung induziert ein Netzwerk multipler Signalmoleküle und proinflammatorischer Entzündungsreaktionen, deren zentraler Mediator NF-kB zu sein scheint. The human intestine faces the gut lumen with only a single layer of epithelium as a selective barrier. This epithelial layer has the gruelling task of blocking the passage of toxins and pathogens, while ensuring digestion and resorption of food. Damage to the mucosa and epithelium can lead to the influx of antigens to the intestinal wall. Recognition and clearance of these pathogens are critical to the survival of the organism. Pattern recognition receptors (PRRs), which also include members of the intracellular NOD protein family recognize molecular patterns of various pathogens (PAMPs). One specific member -NOD2/CARD15 - has been linked to susceptibilty to Crohns Disease (CD), an inflammatory bowel disease. NOD2/CARD15-mediated signalling results in activation of transcription factor NF-kB, which induces expression of pro-inflammatory cytokines. To date, the etiology of CD is unclear. Besides genetic and ecologic factors the luminal flora seems to be involved in the pathogenesis of the chronic intestinal inflammation. The aim of the study was to establish a link between NOD2/CARD15-mediated signalling and bacterial translocation to intestinal tissue in CD patients. The study revealed that translocation of luminal bacteria and/or bacterial products into epithelial tissue induces signal cascades that initiate or maintain intestinal inflammation; and this was strongly correlated to the NOD2/CARD15 genotype of the patient.Oral tolerance, a phenomenon of healthy individuals, prevents an immune response against commensal luminal flora and food antigens. In CD patients, oral tolerance is disrupted, resulting in a hyperreactive NF-kB-mediated immune response. Investigations on the links among bacterial translocation, regulation of NOD2/CARD15 and Nalp3 and the pathogenesis of CD intestinal inflammation revealed: (i) muramyldipeptide (MDP), an element of the bacterial cell wall, induces the NOD2/CARD15 promoter and also NOD2/CARD15 genotype-specific activation of NF-kB-signalling in vitro, (ii) a NOD2/CARD15 genotype-specific activation of NF-kB observed in intestinal tissue of CD-patients and (iii) a detectable increase in Nalp3-mRNA and protein in intestinal macrophages (IMAC) from CD patients.Nalp3 is part of a protein complex, the Nalp3 inflammasome, which forms a molecular platform for the activation of the pro-inflammatory caspase-1. It was shown that activation of the Nalp3 inflammasome mediates processing of pro-caspase-1 as well as the maturation of IL-18. The multi-cellular spheroid model which mimics the differentiation of blood monocytes into the reactive IMAC population, confirm differences in the yields of Nalp3 in IMAC of CD patients. Furthermore, it was shown that excessive bacterial stimulation of IMAC in CD patients results in a deregulation of tissue-degrading enzymes; and the activity of NADPH-oxidase and hence, the production of reactive oxygen species was also increased in CD patient IMACs. Moreover, higher mRNA and protein levels of tissue-degrading proteases cathepsin B and cathepsin L were detected in IMACs and intestinal tissue of CD patients after stimulation with MDP in vitro. By inhibition of enzyme activity (cathepsin D and cathepsin B/L) in the experimental DSS-colitis mouse model, a new therapeutic approach for IBD could be generated in vivo.In addition, microbial stimuli change auto-protective mechanisms of the intestinal epithelium during CD. After it was shown that the intestinal mucus of CD-patients has a strong adherence to bacteria, the potential of translocation into the intestinal tissue was investigated. The accumulation of bacterial endotoxin in the intestinal tissue of CD-patients also revealed NOD2/CARD15 genotype-specific differences. It was assumed that cell-cell contacts are the potential route for translocation. In summary the data of this work show, that in Crohns Disease, a translocation of luminal bacteria and/or bacterial products occurs via the passage of epithelial cell-cell-contacts. Intracellular bacterial stimulation induces a network of multiple signalling molecules and pro-inflammatory reactions, for which NF-kB is implicated as a central mediator.