Conformational changes in DNA and MutS during mismatch repair in Escherichia coli, analyzed by fluorescence spectroscopy

Abstract

Conformational changes both in DNA and MutS during the initial steps of DNA mismatch repair system and during the ATPase cycle were analyzed using state-of-the-art fluorescence techniques, down to the single molecule level. MutS binds mismatches with preferred orientations: MutS scans the DNA for base-base mismatches and small insertion-deletion loops. A hallmark of the mismatch recognition mechanism is DNA kinking by 45º-60º as observed in the co-crystal structure of MutS-DNA complexes from bacteria to man. The change in the distance of two positions in the DNA upon kinking was exploited by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). 16 different 42bp oligonucleotides containing all possible base-base in a central position, with an acceptor fluorophore on the top strand and a donor on the bottom strand, were tested for DNA binding and kinking by MutS using an in-solution FRET assay. Single molecule techniques were used to analyze the binding and bending modes of MutS at highest resolution. The results demonstrate that MutS binds certain mismatches with a preferred orientation. The preferential binding orientation may have important impact on the coupling of mismatch repair and replication, in particular on the mechanism involving directed loading of the heterodimeric MutSalpha by interaction with the replication factor PCNA. Nucleotide influence of the DNA binding: The double labeled G:T oligonucleotide was used to determine the binding and bending kinetics of MutS (member of the ABC ATPase family) to DNA in the presence of ADP, ATP and ADPnP. In addition, the influence of nucleotide on the MutS-induced DNA bending was analyzed using single-molecule techniques to determine the bent/kinked populations present with each nucleotide. The results showed that the association of MutS to DNA in the presence of ADP involves at least a two step mechanism, possibly a fast binding/bending step followed by a kinking at the mismatch. A quantitative analysis of the FRET population showed that the DNA with MutSADP almost homogeneous forming mainly a kinked/bent complex. In contrast, complex formed in the absence of nucleotide or in the presence of ATP are more heterogenous involving at least two complexes, one of which is kinked/bent whereas the others are either unbent or bound not at the mismatch. Pre-steady state kinetic analysis of MutS-DNA association in the presence of ATP and MutS-DNA dissociation in the presence of ATP, ADP or ADPnP revealed distinct phases depending on the nucleotide state of the starting complex. Communication between ATPase domain and clamp domain: In the present work conformational changes in MutS were monitored using a FRET analysis employing single-cysteine variants of MutS. To simplify the data analysis a fully functional single-cysteine dimer variant of MutS was generated thereby avoiding complication due to the formation of tetramers in case of wild type MutS. The work presented here shows that single-cysteine mutants of MutS could be fluorescently labeled with one or two fluorophores suitable for FRET analysis without affecting the function of the protein, e.g. in DNA binding, mismatch recognition and mismatch-provoked MutH activation. Sedimentation velocity analysis and in-solution FRET measurements demonstrated that the fluorescently labeled MutS forms stable dimers in the presence of DNA or nucleotide. Binding of the non-hydrolyzable ATP-analogue ADPnP resulted in a closed, compact form of MutS which is unable to bind to DNA. The dynamics of conformational changes in the clamp domain upon DNA and/or nucleotide binding were monitored using stopped-flow. Based on these data the clamp domain of MutS exists in at least four different states. The data obtained from the fluorescence analysis using double labeled DNA, labeled DNA/labeled MutS and double labeled MutS were included in model for the DNA binding and ATPase cycle of MutS. In der vorliegende Arbeit wurden Konformationsänderungen in DNA und MutS, die in den initialen Schritten des DNA-Fehlerreparatursystems und des ATPase Zyklus von MutS vorkommen, mittels Fluoreszenztechniken bis auf Einzelmolekülebene untersucht. MutS bindet Basenfehlpaarungen mit bevorzugte Orientierungen: MutS untersucht die DNA auf Basenfehlpaarungen und Insertions/Deletionsschleifen (IDLs). Ein Kennzeichen des DNA-Reparatursystems ist das DNA biegen/knicken durch MutS, das zuerst in den Ko-Kristallstrukturen von bakteriellen und später auch humanes MutS beobachtet worden ist. DNA-Biegung führt zu Abstandsänderung zwischen zwei Punkten auf der DNA; solche Änderungen lassen sich mittels FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) untersuchen. Hierzu wurden 16 doppelsträngige Oligonukleotide mit alle möglichen Basenpaarungen an einer zentralen Position und jeweils einem Akezeptor-Fluorophor im oberen und einem Donor-Fluorophor im unterem Strang hergestellt. Zur Untersuchung der MutS DNA-Bindung und DNA-Biegung wurden FRET-Experimente durchgeführt. Einzelmolekül-Experimente, die verschiedenste Eigenschaften der Fluorophore gleichzeitig detektieren, ermöglichten, Details zum Bindungs- und Biegungmodus der MutS-DNA-Komplexe klären. Die Ergebnisse zeigen, dass MutS bestimmte Basenfehlpaarungen mit eine bevorzugte Orientierung bindet. Die bevorzugte Orientierung von MutS hat Konsequenzen für die Geometrie und Orientierung des MutS-MutL-Komplexes, der die nachfolgenden Schritte der DNA-Reparatur koordiniert. Die Erkennung bestimmter Fehlpaarung in nur einer Orientierung hat wichtige Implikationen im Zusammenhang der Kopplung von Fehlpaarungsreparatur und Replikation im eukaryontischen System. Beeinträchtigung des Nukleotides auf die DNA-Bindung: Doppelt-Fluorophor-markierte doppelsträngige Oligonukleotide sind für die Bestimmung der Kinetik von DNA-Bindung und Biegung durch MutS (ABC ATPase) in Ab- und Anwesenheit von ADP, ATP und ADPnP untersucht worden. Zusätzlich wurde der Einfluss verschiedener Nukleotide auf die MutS-induzierte DNA-Biegung in Enzelmolekülexperimenten untersucht, um Subpopulationen zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten, daß die Assoziation von DNA und MutS in der Anwesenheit von ADP mindestens in zwei Schritten erfolgt, die einem Bindung/Biegungsschritt und einem DNA-Knicken zugeordnet werden konnten. Die quantitative Analyse der FRET Populationen zeigte zudem, daß in der Anwesenheit von ADP, MutS einen weitgehend homogenen, spezifischen Komplex mit geknickter DNA bildet. Im Gegensatz hierzu sind die DNA/MutS Komplex in der Abwesenheit von Nukleotid oder in der Anwesenheit von ATP heterogener, u.a, unter Ausbildung zusätzlicher umgebogener Komplexe. Die kinetische Analyse der MutS/DNA Assoziation in der Anwesenheit von ATP und Dissoziation in der Anwesenheit von ADP, ATP oder ADPnP zeigten verschiedene Phasen, die abhängig von dem Nukleotid-Zustand des initialen DNA/MutS-Komplexes waren. Kommunikation zwischen die ATPase-Domäne und die clamp domäne: Die Konformationsumwandlung der clamp-Domäne von MutS wurden in der vorliegenden Arbeit mittels fluorophormarkierter Einzelcysteinvarianten und FRET untersucht. Zur Vereinfachung der Analyse wurde eine Einzelcysteinvariante erzeugt, die nur noch als Dimer vorliegt, um Komplikationen zu vermeiden, die bei der Verwendung der tetramerbildenden MutS-Wildtyp zu erwarten waren. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß Einzelcysteinvarianten von MutS Varianten ohne Funktionsverlust (z.B. DNA Bindung, Fehlererkennung und fehlerinduzierte MutH-Aktivierung) fluorophormarkiert werden können. Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse und in-Lösung FRET Messugen zeigten, daß fluorophormarkiertes MutS stabile Dimere in der Anwesenheit von DNA und Nukleotid bildet. Die Bindung des nicht-hydrolysierbaren ATP Analogs ADPnP überführt MutS in eine geschlossene, kompakte Form, die nicht mehr zur DNA-Bindung fähig ist. Die Dynamik der Komformationsumwandlugen in der clamp-Domäne von MutS nach DNA- und/oder Nukleotid-Bindung wurden durch schnelle Kinetiken untersucht. Aus den Ergebnissen lässt sich folgern, daß die MutS clamp-Domäne in mindestens vier verschiedene Zustände vorliegen kann. Die durch FRET-Experimente erhaltenen Ergebnisse wurden in ein kinetisch/strukturelles Modell des MutS-DNA-Bindung und ATPasezyklus integriert.