Funktionelle Bedeutung der miRNA Expression während der Entstehung der Atherosklerose und Restenose

Abstract

Die Apoptose, Migration und besonders die Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen (SMCs) spielt in vaskuloproliferativen Erkrankungen wie der Atherosklerose und Restenose eine entscheidende Rolle.Ziel der vorliegenden Arbeit war die genaue Untersuchung der Rolle von miRNAs innerhalb dieser Prozesse.MiRNAs sind kleine, einzelsträngige RNA Moleküle, welche die Genexpression durch Bindung an die mRNA von Zielgenen und die darauffolgende Degradierung der mRNA oder Repression der Translation regulieren. Die miRNA-prozessierenden Enzyme Dicer und Drosha sind während der Atherosklerose und während der Restenose im Tiermodell signifikant vermindert exprimiert. Eine Inhibierung der Expression der beiden Enzyme in SMCs führte zu einer Dysregulation der miRNA Expression und einer signifikanten Verstärkung der Proliferation und auch Migration in vitro, wohingegen kein Effekt auf Apoptose detektierbar war. Als mögliche Ursache für diesen pro-proliferativen Effekt konnte die Hochregulation einiger Zellzyklusgene (SKP2, CDK6, CDK2, DDX11) identifiziert werden. Für die in vivo beobachtete Expressionsregulation von Dicer und Drosha konnte ebenfalls ein Mechanismus aufgeklärt werden. So bindet der FoxO1 Transkriptionsfaktor unter serumfreien Bedingungen an die Promoterregion von Dicer und induziert dessen Transaktivierung. Nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren (FCS) kommt es über den PI3K/Akt-Signaltransduktionsweg zu einer Phosphorylierung und damit Inaktivierung von FoxO1, was in einer verminderten Transaktivierung und Expression von Dicer resultiert.Die in vitro-Daten der verstärkten Proliferation in SMCs nach Knockdown von Dicer bzw. Drosha konnten auch in vivo bestätigt werden. Eine kombinierte Runterregulation von Dicer und Drosha führte im Dilatationsmodell der Maus zu einer signifikant verstärkten Neointimaentwicklung und einem erhöhten Anteil proliferierender Zellen im Bereich der Neointima und Media im Vergleich zur Kontrolle.Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass die miRNA-prozessierenden Enzyme Dicer und Drosha und damit miRNAs einen bedeutenden Einfluss auf vaskuloproliferative Prozesse besitzen.Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Identifizierung von miRNAs, die während der Atherosklerose bzw. Restenose reguliert werden und der weiteren Charakterisierung von miR-143, miR-145 und miR-146a.MiR-146a wurde sowohl während der Atherosklerose als auch der Restenose im Mausmodell hochreguliert aufgefunden. Als Ursache hierfür konnten inflammatorische Reize verantwortlich gemacht werden. Eine inhibierte miR-146a Expression hat einen anti-proliferativen Effekt in SMCs. MiR-143 und -145 bilden ein eigenständiges Cluster, d.h. sie werden gemeinsam transkribiert. Dafür spricht auch eine ähnliche Expressionsregulation. So werden beide miRNAs infolge von mitogener und auch inflammatorischer Stimulation verringert exprimiert. Auch während der Restenose im Mausmodell ist ihre Expression herunterreguliert.Eine Transfektion mit miRNA-Precursorn führte zu einer signifikant verringerten Proliferation von SMCs in vitro, die sich nur deutlich abgeschwächt in Endothelzellen (ECs) wiederfand. Als mögliche Zielgene für miR-143 konnten CDK5RAP2 (Cyclin-abhängige Kinase 5 assoziierte regulatorische Untereinheit 2), sowie CDK4 (Cyclin-abhängige Kinase 4) identifiziert werden. Zusammengefasst geben diese Daten einen deutlichen Hinweis darauf, dass miRNAs eine wichtige funktionelle Bedeutung für SMCs inne haben und ihre Beeinflussung ein vielversprechender neuer Ansatz zur Therapie vaskuloproliferativer Erkrankungen darstellen könnte. Micro RNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that regulate gene expression on posttranscriptional level by binding their target mRNA. They are implicated to regulate mRNA levels of up to 30% of mammalian genes, comprising key regulators for cellular function. Maturation and expression of miRNAs is tightly controlled by the two processing enzymes Dicer and Drosha. Up to now, the role of miRNAs for vascular smooth muscle cell (VSMC) function remains elusive. Thus, the aim of this study was to evaluate the regulation and impact of Dicer and Drosha for smooth muscle cell function during the development of neointimal lesions in vitro and in vivo and to screen miRNA expression in this setting.Mouse models for atherosclerosis and restenosis revealed a significant down regulation of Dicer and Drosha expression on mRNA and protein level in diseased vessels. A siRNA-mediated knock down of Dicer or Drosha in human coronary SMCs led to an accelerated cell cycle progression as determined by FACS analysis and increased VSMC proliferation, migration but not apoptosis. The pro-proliferative outcome might be originated from the upregulation of several pro-proliferative genes (CDK4, CDK6, SKP2). For the in vivo observed expression pattern of Dicer a possible mechanism could be elucidated. Thus, the foxO1 transcription factor binds under serumfree conditions to its promoter region and facilitates gene expression. Upon the presence of growth factors, the PI3K/Akt pathway becomes activated; this resulted in foxO1 phosphorylation and therefore inactivaction. The transcription of Dicer was stopped.The in vitro data were confirmed in an in vivo setting. Here, a combined knock down of Dicer and Drosha entailed a significantly increased neointima formation following wire injury. Taken together, the results indicate a tremendous influence of the miRNA-processing enzymes Dicer and Drosha on vascular proliferative processes.The second part of this project focussed on the identification and characterisation of miRNAs that are aberrantly expressed during atherosclerosis and restenosis.MiR-146a could be identified as upregulated during both diseases due to inflammatory stimuli. A knock down of miR-146a in SMCS revealed an anti-proliferative effect.MiR-143 and -145 form an independent cluster and are therefore transcribed corporately. This suggests a similar expression pattern. And indeed, both miRNAs are downregulated upon mitogenic and inflammatory stimulation in vitro. During restenosis in murine femoral arteries, there is as well a significantly reduced expression. Transfection with a precursor of miR-143 and miR-145 led to a significantly reduced proliferation in SMCs, whereas the proliferative rate in ECs was less affected. CDK5RAP and CDK4 could be identified as possible target genes for miR-143. Both genes are downregulated following enhanced miR-143 expression and belong to in silico predicted target genes. Further experiments will be necessary to confirm this finding.In summary, these data indicate that miRNAs inhibit important functions for SMCs and therefore might represent a possible target for future treatment of vascular proliferative diseases.