Generation of novel inhibitor-variants for beta-beta-alpha-metal finger nucleases by evolution and rational protein design

Abstract

EndA ist eine unspezifische Nuklease, die auf der Oberfläche des pathogenen Bakteriums Streptococcus pneumoniae lokalisiert ist. Dort ist sie an der Fragmentierung doppelsträngiger DNA zu einzelsträngigen Segmenten beteiligt, die während kompetenter Phasen des Bakteriums aufgenommen werden. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass EndA effektiv das DNA Gerüst so genannter NETs (Neutrophil Extracellular Traps) degradiert. Mit diesen netzartigen Strukturen sind bakterizide Proteine wie Histone und Elastasen assoziiert, die zum Absterben gebundener Bakterien führen können. Mikroben, die durch den spezifischen DNA Abbau somit der Immunabwehr von Säugern entkommen, können schwere invasive Krankheiten auslösen.In dieser Arbeit wurden gezielt EndA Varianten mit Punktmutationen erzeugt, die das konservierte H-N-H/N Motiv betreffen. Die entsprechenden Varianten konnten aufgrund ihrer Toxizität nur mit Hilfe eines zellfreien Expressionssystems hergestellt werden. Allerdings konnte die inaktive Variante H160A in E. coli exprimiert und die nukleolytische Aktivität durch einen Überschuss an Imidazol im Reaktionspuffer wieder hergestellt werden (chemical rescue). Der Verlust der katalytischen Aktivität entstand durch den Austausch der generellen Base Histidin zu Alanin innerhalb des H-N-H/N Motivs. Des Weiteren konnte gezeigt werden, das Asparagin 182 (H-N-H/N) an der Stabilisierung des Proteins beteiligt ist, während Asparagine 192 das benötigte zweiwertige Metallion im aktiven Zentrum bindet (H-N-H/N). Bis heute wurde für die toxische Nuklease EndA kein Inhibitor entdeckt, der ein möglicher Ansatz für eine entsprechende Therapie für durch Streptokokken verursachte Krankheiten sein könnte. Allerdings sollte es möglich sein, basierend auf dem bekannten Inhibitor NuiA für die homologe Nuklease NucA einen funktionellen Inhibitor für EndA und andere homologe Nukleasen (Serratia Nuklease) herzustellen. Der in dieser Arbeit entwickelte Selektionsassay erwies sich allerdings als zu instabil, sodass kein Inhibitor isoliert werden konnte. Eine mögliche Alternative könnte ein yeast two-hybrid Assay sein, mit dessen Hilfe entsprechende NuiA Varianten aufgrund ihrer Interaktion mit EndA H160A isoliert und im Weiteren auf ihre inhibitorische Funktion überprüft werden könnten. EndA is a membrane-attached surface exposed DNA-entry nuclease previously known to be required for genetic transformation of Streptococcus pneumoniae. More recent studies have shown that the enzyme also plays an important role during establishment of invasive infections by degrading neutrophil extracellular traps (NETs), enabling streptococci to overcome the innate immune system in mammals. This work presents the first mutational and biochemical analysis of recombinant forms of EndA produced either in a cell-free expression system or in E. coli. Histidine at position 160 and Asn191 were identified to be essential for catalysis and Asn182 (corresponding to the central asparagine residue in the well known H-N-H-motif found in many nucleases) to be required for the stability of EndA. The role of His160 (H-N-H) as the putative general base in the catalytic mechanism is supported by chemical rescue of the H160A variant of EndA with imidazole added in excess.Although EndA appeared to be highly toxic for the cell, no functional inhibitor for EndA could be isolated up to now. Such a protein inhibitor might be an interesting starting point for a possible drug design. A detailed comparison of EndA with other non-specific nucleases revealed a high sequence homology especially at the active site with NucA from Anabaena sp. However, NucA occurs in a complex with its specific inhibitor NuiA. As NuiA blocks the active site of NucA it should be feasible to select functional inhibitors from a NuiA based library for EndA and other homologous nucleases such as the Serratia nuclease. Unfortunately, the established plasmid based assay appeared to be too instable and no candidate inhibitor could be isolated. Furthermore, the highly toxic nuclease EndA could not be cloned and expressed in an active form in E. coli so far. A yeast two-hybrid assay might be used to screen a NuiA library for a protein-protein interaction with the inactive/non-toxic EndA H160A variant.